Chromogenic Coliforms Agar (CCA) ISO

L'interazione degli ingredienti del terreno, come peptone, sorbitolo e piruvato, assicura una crescita rapida delle colonie, compresi i coliformi infettivi, e permette anche il recupero dei coliformi con danno termico subletale. Tergitol-7 inibisce i batteri Gram-positivi e alcuni Gram-negativi senza influire sui batteri coliformi. Il cloruro di sodio mantiene l'equilibrio osmotico e i sali di fosfato agiscono da sistema tampone. L'agar batteriologico è l'agente solidificante.

La rilevazione della beta-glucuronidasi è molto usata per differenziare Escherichia coli, perché l'enzima è presente in E. coli ma non negli altri membri del gruppo dei coliformi. La miscela cromogenica contiene i substrati cromogenici Salmon-GAL e X-glucuronide. Gli enzimi prodotti dai coliformi, beta-D-galattosidasi e beta-D-glucuronidasi, scindono questi substrati e danno alle colonie batteriche colorazioni diverse. La beta-D-galattosidasi scinde il substrato Salmon-GAL e dà alle colonie di coliformi un colore rosso salmone. La beta-D-glucuronidasi, enzima caratteristico di E. coli, scinde l'X-glucuronide e dà a queste colonie un colore blu. E. coli possiede i due enzimi e scinde entrambe le sostanze cromogeniche, dando colonie da blu scuro a viola. I coliformi totali sono la somma delle colonie di E. coli e delle colonie rosso salmone. L'aggiunta di triptofano al terreno permette di eseguire la prova dell'indolo per un'ulteriore conferma di E. coli.

Formula tipica in g/L, adattata e/o integrata secondo necessità per soddisfare i criteri di prestazione.

Preparazione

Sospendere 26,45 grammi di terreno in un litro di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. EVITARE DI SURRISCALDARE. NON STERILIZZARE IN AUTOCLAVE. Raffreddare a 45-50 °C, omogeneizzare delicatamente e distribuire in piastre di Petri.

Secondo ISO 9308

Per la conta di E. coli e dei batteri coliformi secondo ISO 9308:

1. Filtrare il campione su una membrana.
2. Porre il filtro a membrana su una piastra di E. coli Coliforms Chromogenic Agar.
3. Capovolgere la piastra di Petri e incubare a 36 ± 2 °C per 21 ± 3 h.
4. Contare le colonie beta-D-galattosidasi-positive (di colore da rosa a rosso) come batteri coliformi presuntivi diversi da E. coli.
5. Per evitare risultati falsi positivi dovuti a batteri ossidasi-positivi, per esempio Aeromonas spp., confermare le colonie batteriche con una reazione ossidasi-negativa.
6. Le colonie positive alla beta-D-galattosidasi e alla beta-D-glucuronidasi (da blu scuro a viola) si contano come E. coli.
7. La conta totale dei batteri coliformi è la somma delle colonie ossidasi-negative, beta-D-galattosidasi-positive (da rosa a rosse) e di tutte le colonie da blu scuro a viola.
8. Alcuni ceppi di Shigella contengono l'enzima beta-D-glucuronidasi e possono crescere come colonie azzurre.

• ISO 9308-1/2014 Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora.
• ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations.
• Byamukama D., Kansiime F., Mach R.L., Farnleitner A.H. Determination of Escherichia coli Contamination with Chromocult Coliform Agar Showed a High Level of Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in Tropical Waters of Kampala, Uganda. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66 pp. 864-868.
• Geissler K., Manafi M., Amoros I., Alonso J.L. Quantitative determination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media. J. Appl. Microbiol. 2000, 88 pp. 280-285.
• Ossmer R., Schmidt W., Mende U. Chromocult Coliform Agar - Influence of Membrane Filter Quality on Performance. Poster presentation, 1999. Congreso de la Sociedad Española de Microbiologia, Granada, Spain.
• USEPA: 40 CFR Part 141 (sec. 141.21) Federal Register/Vol. 67, No. 209, Tuesday October 29, 2002/Rules and Regulations.
• Lange B., Strathmann M., Ossmer R. Performance validation of chromogenic coliform agar for the enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 2013, 57 pp. 547-553.