Chromogenic Coliforms Agar (CCA) ISO

Descrizione

La selettività è ottenuta, in parte, con Tergitol 7, che inibisce la crescita dei batteri Gram-positivi e di alcuni Gram-negativi senza influire sui batteri coliformi. Il terreno di coltura è stato formulato senza antibiotici per i campioni di acqua con bassa flora batterica di fondo.

La differenziazione delle colonie è dovuta alla miscela cromogenica, composta da due substrati enzimatici: 6-cloro-3-indossil-beta-D-galattopiranoside (Salmon-GAL) e 5-bromo-4-cloro-3-indossil-beta-D-glucuronide (X-Glucuronide).

Il primo è scisso dall'enzima caratteristico dei coliformi, la beta-D-galattosidasi, e dà alle colonie di coliformi un colore rosso salmone. La seconda sostanza cromogenica è scissa dall'enzima beta-D-glucuronidasi, caratteristico di E. coli, e colora di blu le colonie di questi batteri.

E. coli possiede i due enzimi e scinde entrambe le sostanze cromogeniche, dando colonie da blu scuro a viola. I coliformi totali sono la somma delle colonie di E. coli e delle colonie rosso salmone. L'IPTG potenzia il metabolismo delle sostanze cromogeniche.

Gli altri batteri Gram-negativi producono colonie incolori, tranne alcuni che hanno attività glucuronidasica (ma non galattosidasica) e producono colonie da azzurro a turchese.

Per confermare le colonie di E. coli, nel terreno è inclusa una piccola quantità di triptofano che permette di verificare la produzione di indolo: coprire le colonie blu-viola con una goccia di Kovac's Reagent. Se in pochi secondi il reattivo diventa rosso ciliegia, è confermata la produzione di indolo e quindi la presenza di E. coli.

Quando Chromogenic Agar for Coliform si usa con il metodo della membrana filtrante, il colore e la crescita delle colonie possono essere modificati dalle caratteristiche della membrana filtrante. È consigliabile eseguire una validazione del tipo di membrana filtrante usato.

Limiti della procedura

La produzione di beta-galattosidasi, pur comune a tutti i coliformi, varia da un ceppo all'altro ed è influenzata dalla temperatura e dal tempo di incubazione. A temperature superiori a 37 °C la sua produzione diminuisce, con una perdita di intensità del colore rossastro, mentre nei ceppi di Escherichia coli si accentuano le tonalità bluastre.

Se si usa il metodo della filtrazione su membrana, bisogna tenere conto che anche la natura e le caratteristiche della membrana filtrante usata influiscono sulle dimensioni e sul colore delle colonie cresciute su questo terreno di coltura.

Tecnica

La tecnica di inoculo usata con queste piastre è la tecnica di filtrazione su membrana (MF) secondo le varie farmacopee armonizzate e le norme ISO applicabili. Il campione di acqua si filtra su un filtro a membrana con pori di diametro 0,45 µm, validato secondo la norma ISO 7704:1985. La membrana si pone poi sulla superficie del terreno CCA, evitando di intrappolare bolle d'aria tra la membrana e la superficie dell'agar. La piastra di Petri con la membrana si incuba per 18-24 ore a 36 ± 2 °C. Se a 18 h c'è crescita di colonie rosse o incolori, prolungare l'incubazione fino a 24 h per includere le reazioni tardive della beta-galattosidasi o della beta-glucuronidasi. Contare le colonie beta-galattosidasi positive e beta-glucuronidasi negative (tutte le colonie di colore da rosa salmone a rosso) come batteri coliformi diversi da E. coli. Contare le colonie beta-galattosidasi positive e beta-glucuronidasi positive (tutte le colonie di colore da blu intenso a viola) come E. coli.

La conta dei coliformi totali si ottiene sommando le colonie da rosa salmone a rosso e le colonie da blu intenso a viola. Calcolare la concentrazione dei batteri coliformi e di E. coli in 100 mL dal volume iniziale di acqua filtrata e dal numero di colonie caratteristiche contate sulla membrana. I risultati si esprimono in unità formanti colonia per millilitro (UFC/mL).

Controllo fisico-chimico

Controllo microbiologico

Inoculo: intervallo pratico 100 ± 20 UFC, minimo 50 UFC (produttività).

Controllo microbiologico secondo ISO 11133:2014/Amd 1:2018.

Aerobiosi. Incubazione a 36 ± 2 °C, lettura a 18-24 h.

Controllo di sterilità

Incubazione 48 ore a 30-35 °C e 48 ore a 20-25 °C: NESSUNA CRESCITA.

Controllo a 7 giorni dopo l'incubazione nelle stesse condizioni.

• ADAMS, M., R. GRUBB, S.M. HAMER & A. CLIFFORD (1990) Colorimetric enumeration of Escherichia coli based on beta-glucuronidase activity. Appl. Environ. Microbiol. 56:2021.
• ISO 7704 Standard (1985) Water Quality - Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses.
• ISO 9308-1:2014/Amd.1:2016(E) Water quality. Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora.
• KILIAN, M. & P. BÜLOW (1976) Rapid Diagnostic of Enterobacteriaceae. I. Detection of bacterial glycosidases. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B 84:245-251.
• ISO 11133:2014/Amd 1:2018. Microbiology of food, animal feed and water. Preparation, production, storage and performance testing of culture media.
• MANAFI, M. & W. KNEIFEL (1989) A combined chromogenic-fluorogenic medium for the simultaneous detection of total coliform and E. coli in water. Zentralbl. Hyg. 189:225-234.
• UNE-EN ISO 11133 (2014). Microbiología de los alimentos para consumo humano, alimentación animal y agua - Preparación, producción, conservación y ensayos de rendimiento de los medios de cultivo.
• TURNER, K.M., L. RESTAINO & E.W. FRAMPTON (2000) Efficacy of Chromocult Coliform Agar for coliform and Escherichia coli detection in Foods. J. Food Protect. 63(4):539-541.