E. coli-Coliforms Chromogenic Agar Base (BOE)

L'interazione degli ingredienti del terreno, come peptone, sorbitolo e piruvato, assicura una crescita rapida delle colonie, compresi i coliformi infettivi, e permette anche il recupero dei coliformi con danno termico subletale. Tergitol-7 inibisce i batteri Gram-positivi e alcuni Gram-negativi senza influire sui batteri coliformi. La selettività è aumentata dalla cefsulodina e dalla vancomicina, fornite da E. coli-Coliforms Supplement (LC-6041), che agiscono contro Pseudomonas e i batteri Gram-negativi ossidasi-positivi, gli enterococchi e gli altri batteri Gram-positivi. Il cloruro di sodio mantiene l'equilibrio osmotico e i sali di fosfato agiscono da sistema tampone. L'agar batteriologico è l'agente solidificante.

La rilevazione della beta-glucuronidasi è molto usata per differenziare Escherichia coli, perché l'enzima è presente in E. coli ma non negli altri membri del gruppo dei coliformi. La miscela cromogenica contiene i substrati cromogenici Salmon-GAL e X-glucuronide. Gli enzimi prodotti dai coliformi, beta-D-galattosidasi e beta-D-glucuronidasi, scindono questi substrati e danno alle colonie batteriche colorazioni diverse. La beta-D-galattosidasi scinde il substrato Salmon-GAL e dà alle colonie di coliformi un colore rosso salmone. La beta-D-glucuronidasi, enzima caratteristico di E. coli, scinde l'X-glucuronide e dà a queste colonie un colore blu. E. coli possiede i due enzimi e scinde entrambe le sostanze cromogeniche, dando colonie da blu scuro a viola. I coliformi totali sono la somma delle colonie di E. coli e delle colonie rosso salmone. L'aggiunta di triptofano al terreno permette di eseguire la prova dell'indolo per un'ulteriore conferma di E. coli.

Nota: alcuni ceppi di Shigella contengono l'enzima beta-D-glucuronidasi e possono crescere come colonie azzurre. Le colonie di E. coli negative alla beta-glucuronidasi sono color salmone, per esempio E. coli O157:H7.

Preparazione

Sospendere 13,25 grammi di terreno in 500 mL di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. EVITARE DI SURRISCALDARE. NON STERILIZZARE IN AUTOCLAVE. Raffreddare a 45-50 °C e aggiungere in condizioni asettiche una fiala di E. coli-Coliforms Supplement (LC-6041). Omogeneizzare delicatamente e distribuire in piastre di Petri.

Istruzioni per l'uso

Si possono usare le tecniche seguenti.

Metodo per spatolamento (Drigalski):

1. In una piastra di Petri, aggiungere 12-15 mL di agar fuso e lasciar solidificare.
2. Inoculare 0,1 mL della sospensione iniziale e/o del campione diluito.
3. Distribuire l'inoculo sulla superficie dell'agar con un'ansa sterile.
4. Incubare le piastre capovolte a una temperatura di 36 ± 2 °C per 18-24 ore.

Metodo per inclusione:

1. Depositare 1 mL della sospensione iniziale e/o del campione diluito in una piastra di Petri vuota.
2. Aggiungere in ogni piastra di Petri 12-15 mL di agar raffreddato a 45 °C e mescolare muovendo delicatamente la piastra.
3. Lasciar solidificare le piastre e incubarle capovolte a una temperatura di 36 ± 2 °C per 18-24 ore.

Metodo di filtrazione su membrana:

1. Asciugare la superficie delle piastre preparate.
2. Filtrare un volume adeguato di campione attraverso la membrana.
3. Porre la membrana sulla superficie della piastra di agar, evitando la formazione di bolle d'aria.
4. Capovolgere le piastre e incubare a 36 ± 2 °C per 18-24 ore.

Incubare fino a 24 ore per osservare eventuali reazioni ritardate di beta-galattosidasi e beta-glucuronidasi.

• Alonso, J.L. Soriano, K., Amoros I., Ferrus, M.A. 1998 Quantitative determination of E. coli and fecal coliforms in water using a chromogenic medium.
• BOLETÍN OFICIAL DEL ESTADO. Num. 78 Martes 31 de marzo de 2009 Sec. I. Pág. 30417. Orden SCO/778/2009, de 17 de marzo, sobre métodos alternativos para el análisis microbiológico del agua de consumo humano.