Giolitti-Cantoni Broth ISO

Il peptone di caseina e l'estratto di manzo forniscono azoto, vitamine, minerali e aminoacidi essenziali per la crescita. L'estratto di lievito è fonte di vitamine, in particolare del gruppo B, essenziali per la crescita batterica. Il cloruro di sodio fornisce gli elettroliti essenziali per il trasporto e l'equilibrio osmotico. Il mannitolo è il carboidrato fermentabile che fornisce carbonio ed energia. Il cloruro di litio inibisce la crescita dei batteri Gram-negativi. Il polisorbato 80 è aggiunto per neutralizzare fenoli, esaclorofene e formalina. La crescita degli stafilococchi è favorita dal piruvato di sodio e dalla glicina. I contaminanti Gram-negativi sono inibiti dal tellurito di potassio.

Questo metodo è raccomandato per i prodotti in cui si prevede che gli stafilococchi siano stressati e presenti in numero ridotto, come i prodotti essiccati. Gli stafilococchi coagulasi-positivi saranno per lo più Staphylococcus aureus, ma anche Staphylococcus intermedius e alcuni ceppi di Staphylococcus hyicus sono coagulasi-positivi.

La conferma degli stafilococchi che producono coagulasi si basa su una reazione della coagulasi fortemente positiva, ma è noto anche che alcuni ceppi di stafilococchi coagulasi-positivi danno reazioni della coagulasi debolmente positive. Questi ultimi ceppi si possono confondere con altri batteri, ma si possono differenziare con prove aggiuntive, come quella della produzione di termonucleasi.

Preparazione

Sospendere 55,2 grammi di terreno in un litro di acqua distillata per preparare il brodo a concentrazione semplice. Sospendere 110,4 grammi di terreno in un litro di acqua distillata per preparare il brodo a doppia concentrazione. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. Distribuire in provette porzioni da 9 mL per il brodo a concentrazione semplice e da 10 mL per il brodo a doppia concentrazione. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Raffreddare a 45-50 °C e aggiungere in asepsi, per provetta, 0,1 e 0,2 mL di soluzione di tellurito di potassio all'1 %, rispettivamente per la concentrazione semplice e per la doppia concentrazione.

Secondo ISO 6888-3

Per la conta degli stafilococchi coagulasi-positivi secondo ISO 6888-3:

1. Inoculare una quantità specificata della porzione da analizzare o della sospensione iniziale per il metodo di rilevazione, oppure le diluizioni seriali per il metodo di conta, in un terreno di coltura selettivo (Giolitti-Cantoni Broth).
2. Aggiungere 1 mL della sospensione iniziale a 9 mL di Giolitti-Cantoni Broth a concentrazione semplice.
3. Aggiungere 10 mL della sospensione iniziale a 10 mL di Giolitti-Cantoni Broth a doppia concentrazione.
4. Per volumi maggiori di porzioni da analizzare, preparare la sospensione iniziale aggiungendo x mL o x g di porzione da analizzare a 9x mL di diluente. Poi aggiungere tutta la sospensione iniziale a 90x mL di Giolitti-Cantoni Broth a concentrazione semplice, deaerato in precedenza e con l'aggiunta di tellurito di potassio.
5. Incubare le provette a 37 °C in anaerobiosi per 24-48 ore (versare con cura sulla superficie del terreno un tappo di agar o di paraffina, raffreddato a una temperatura tra 44 °C e 47 °C, e lasciarlo solidificare in modo da formare un sigillo).
6. La presenza di stafilococchi coagulasi-positivi presunti è indicata dalla riduzione del tellurito di potassio (annerimento o precipitato nero).
7. Trapiantare le provette presunte positive su piastre di Baird Parker Agar e incubare a 37 °C per 24-48 ore.
8. La presenza di stafilococchi coagulasi-positivi presunti è indicata dalla riduzione del tellurito di potassio e dell'emulsione d'uovo.
9. Confermare le colonie tipiche e/o atipiche con una reazione della coagulasi.

• International Standard ISO 6888-3 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) Part 3: Detection and MPN technique for low numbers.