E. coli O157:H7 / O157 qPCR Kit

Escherichia coli (E. coli) è un batterio che si trova comunemente nell'intestino dell'uomo e degli animali a sangue caldo, e la maggior parte dei ceppi è innocua. Alcuni ceppi, però, come E. coli enteroemorragico (EHEC) O157:H7, possono causare gravi focolai di origine alimentare che provocano nell'uomo diarrea, febbre e vomito. E. coli O157:H7 si riconosce dal suo antigene somatico (della parete cellulare) (O157) e dal suo antigene flagellare (H7). Inoltre, è noto che E. coli O157:H7 produce tossine Shiga-like, che causano sintomi gravi.

Il serbatoio di questo patogeno sembra essere soprattutto il bestiame bovino, oltre ad altri come ruminanti, mammiferi e uccelli.

E. coli O157:H7 si trasmette all'uomo soprattutto con il consumo di alimenti contaminati, come prodotti di carne macinata crudi o poco cotti e latte crudo. Anche la contaminazione fecale dell'acqua e di altri alimenti e la contaminazione crociata durante la preparazione degli alimenti (con carne bovina e altri prodotti a base di carne, superfici contaminate e utensili da cucina) portano all'infezione.

Il kit comprende un controllo interno (IC). L'IC serve a valutare gli inibitori della PCR nel campione o i problemi verificatisi durante la preparazione/amplificazione della PCR. Il kit comprende la master mix per il bersaglio e l'IC, primer e sonde TaqMan marcate con quencher non fluorescenti. Il segnale per la rilevazione dei bersagli è rilevato nei canali FAM (E. coli O157) e HEX/VIC (sierotipo H7), quello per l'IC nel canale ROX. Il kit contiene uracil-DNA glicosilasi (UDG), che previene la contaminazione del DNA con i prodotti di PCR. Nel kit sono compresi anche un controllo positivo, che permette di valutare i primer e le sonde usati per la rilevazione dei bersagli, e un controllo negativo (acqua priva di nucleasi) per confermare l'integrità dei reagenti del kit.

Il kit è stato validato sullo strumento ABI PRISM 7500 Fast. Il kit è compatibile con tutti i termociclatori che lavorano nei canali FAM, JOE/VIC/HEX e ROX. Il kit di rilevazione non deve essere usato per procedure diagnostiche. Solo per uso nel settore alimentare.

1. Arricchimento del campione
2. Estrazione del DNA
3. Preparazione e corsa della PCR
4. Risultati e interpretazione

In conformità alla ISO 9001, ogni lotto del kit è provato rispetto a specifiche predeterminate, per garantire una qualità costante del prodotto.

Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione del DNA e l'amplificazione per PCR, richiedono personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati, dovuti soprattutto alla contaminazione dei campioni o alla degradazione degli acidi nucleici contenuti nei campioni. Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in una sola direzione, partendo dall'area di estrazione e passando all'area di amplificazione e rilevazione.

L'utente deve sempre fare attenzione a quanto segue:

• Leggere tutte le istruzioni fornite prima di eseguire il saggio.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Indossare DPI adeguati, compresi guanti monouso e camici da laboratorio.
• Conservare ed estrarre il materiale positivo separatamente da tutti gli altri reagenti.

Il kit va conservato tra -20 °C e 5 °C e protetto dall'esposizione alla luce. Evitare scongelamenti e congelamenti ripetuti (> 5), perché possono ridurre la sensibilità. Valutare il congelamento in aliquote, per mantenere le prestazioni del saggio.

Il kit contiene i reagenti per 100 reazioni.

• Microcentrifuga
• Cappe a flusso laminare/cappe per PCR
• Guanti monouso senza talco
• Micropipette e puntali con filtro privi di nucleasi
• Strumento per real-time PCR
• Provette/strip/piastre multipozzetto e accessori specifici per ogni strumento
• Tampone di lisi / kit di estrazione del DNA

Arricchimento / estrazione del DNA

Si raccomanda un pre-arricchimento secondo ISO/TS 13136, oppure colonie isolate di E. coli.

Estrazione del DNA

Usare un kit o un protocollo adatto per l'estrazione del DNA, come Complex Extraction Kit (LC-6500), Extraction Rapid (LC-6504, LC-6505) o Extraction Column (LC-6506, LC-6507).

Preparazione della PCR: miscela

Indossare sempre i guanti per tutte le procedure di PCR.

1. Scongelare le soluzioni del kit. Mescolare accuratamente (non agitare su vortex la provetta Enzimi) e centrifugare brevemente.
2. Preparare le reazioni come descritto nella tabella qui sotto.
3. Mescolare la miscela preparata capovolgendo la provetta e centrifugare brevemente.
4. Distribuire aliquote da 15 µL di miscela preparata nei pozzetti della piastra o nelle provette per PCR.
5. Per il controllo negativo, pipettare 5 µL dalla provetta del controllo negativo (tappo trasparente); pipettare 5 µL di campione di DNA per pozzetto; per il controllo positivo, pipettare 5 µL dalla provetta del controllo positivo (tappo rosso). Ogni provetta o pozzetto di PCR deve avere un volume finale di PCR di 20 µL.
6. Centrifugare brevemente i pozzetti della piastra o le provette per PCR.
7. Mettere le reazioni nello strumento per real-time PCR.

Nota: preparare la reazione di PCR per ogni campione oppure, in alternativa, preparare una Master Mix per il numero totale di reazioni più il 10 % (per esempio, per 10 campioni preparare un volume per 11). In questo caso, preparare la miscela in una provetta sterile da 1,5 mL, priva di nucleasi. Includere 2 reazioni di PCR per i controlli positivo e negativo.

Preparazione della PCR: programma

Impostare lo strumento per real-time PCR secondo il seguente programma di temperatura e tempo:

Per l'analisi dei risultati della PCR, selezionare le opzioni di visualizzazione della fluorescenza. I campioni con valori di Ct positivi sono considerati positivi.

Importante: controllare anche le curve di amplificazione, non solo i valori di Ct. I campioni vanno esaminati sia in scala logaritmica sia in scala lineare e confrontati con il controllo negativo. Regolare la soglia (threshold), se necessario. La valutazione dei risultati dei campioni va fatta dopo aver esaminato i controlli positivo e negativo e averne verificato la validità. Se i risultati dei controlli non sono validi, i risultati dei campioni non si possono interpretare.

Interpretazione: controlli

Per validare il saggio, i controlli devono dare i seguenti risultati:

Se i controlli non corrispondono a questi risultati, l'esperimento va ripetuto.

Interpretazione: campioni

L'interpretazione dei risultati dei campioni è riassunta nella tabella seguente:

(1) Quando la rilevazione di E. coli e quella dell'IC sono entrambe negative, nel campione sono presenti inibitori della PCR. Diluire il campione o eseguire un'altra estrazione del DNA.

(2) Un'alta concentrazione del DNA bersaglio nel campione può portare a un segnale di fluorescenza dell'IC ridotto o assente.

1. Esclusività del 100 %, determinata con 13 ceppi di organismi strettamente correlati o presenti nello stesso habitat, tra cui E. coli non patogeni e altri sierotipi di E. coli (Tabella 1).
2. Inclusività del 100 %, determinata su 9 ceppi di E. coli O157:H7 ed E. coli O157 (Tabella 1).

Tabella 1: esclusività e inclusività del kit

Dopo l'arricchimento si può ottenere un limite di rilevazione da 1 a 10 cellule per 25 g di campione alimentare. Il kit ha una sensibilità di reazione di 1 pg di DNA bersaglio.