DNA Extraction Kit Rapid

La lisi avviene per shock termico e un passaggio di centrifugazione elimina parte dei residui cellulari. Il surnatante si può usare direttamente per le reazioni successive, come la rilevazione con real-time PCR, oppure dopo un passaggio di diluizione per eliminare gli inibitori residui della PCR.

Conservare a temperatura ambiente (TA).

• Provette per microcentrifuga (1,5-2,0 mL)
• Micropipette e puntali con filtro per micropipette (10-100 µL e 100-1000 µL)
• Vortex
• Microcentrifuga in grado di arrivare a 14.000 g
• Blocco riscaldante (preferibilmente) o bagnomaria a 95 ± 5 °C
• Guanti senza talco

• Questi prodotti sono esclusivamente per uso in vitro, solo per uso di ricerca (RUO).
• Questi prodotti sono solo per uso nel settore alimentare.
• Il test richiede personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Non usare reagenti di prodotti di altri produttori.
• Indossare guanti monouso e camici da laboratorio quando si manipolano campioni e reagenti.
• Usare puntali sterili con filtro.
• Evitare il contatto di campioni e reagenti con pelle, occhi e mucose. In caso di contatto con queste soluzioni, sciacquare subito con acqua e consultare immediatamente un medico.
• Le schede di dati di sicurezza (MSDS) sono disponibili su richiesta.
• I rifiuti vanno trattati e smaltiti nel rispetto delle norme di sicurezza applicabili.
• Pulire periodicamente il piano di lavoro con ipoclorito di sodio almeno al 5 %.
• Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR.

Prima dell'uso mescolare leggermente il contenuto del kit.

In condizioni ambientali fredde, in alcuni componenti del kit si può formare un precipitato. In questo caso scaldare il componente per circa 5 minuti a 37 °C per sciogliere il precipitato e agitarlo bene prima dell'uso.

Procedura 1: isolamento del DNA batterico da coltura di pre-arricchimento o di arricchimento

Concentrazione del campione:

1. Centrifugare 1 mL di terreno di pre-arricchimento o di arricchimento a > 10.000 g per 5 minuti. Eliminare il surnatante.

Evitare di trasferire residui di alimento dal terreno di arricchimento nella provetta per microcentrifuga.

FACOLTATIVO: prima del passo 2 eseguire un lavaggio: aggiungere 1 mL di PBS sterile, risospendere il pellet e centrifugare a > 10.000 g per 3 minuti. Eliminare il surnatante. Proseguire con il passo 2.

Lisi delle cellule:

2. Pipettare 100-200 µL di Lysis buffer nella provetta per microcentrifuga e risospendere il pellet. Agitare vigorosamente su vortex.
3. Centrifugare brevemente e incubare per 10-15 minuti a 95-100 °C.
4. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.
5. Trasferire il surnatante limpido in una nuova provetta per microcentrifuga.
6. Usare subito il DNA o conservarlo a -20 °C se si vuole riutilizzarlo. Prima del riutilizzo omogeneizzare e centrifugare a > 10.000 g per 2 minuti.

Procedura 2: isolamento del DNA da prodotti lattiero-caseari

1. Pipettare 100 µL di Lysis buffer nella provetta per microcentrifuga.
2. Prelevare una piccola ansata di cellule da una piastra di coltura e sospendere le cellule nel Lysis buffer. Agitare vigorosamente su vortex.
3. Centrifugare brevemente e incubare per 10-15 minuti a 95-100 °C.
4. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.
5. Trasferire il surnatante limpido in una nuova provetta per microcentrifuga.
6. Usare subito il DNA o conservarlo a -20 °C se si vuole riutilizzarlo. Prima del riutilizzo omogeneizzare e centrifugare a > 10.000 g per 2 minuti.

Procedura 3: isolamento del DNA batterico da coltura di arricchimento

Concentrazione:

1. Centrifugare fino a 50 mL alla velocità massima per 10 minuti. Decantare con attenzione il liquido, lasciandone circa 1 mL nel cono della provetta.

(Centrifugare volumi tra 1 mL e 50 mL.)

Lavaggio:

2. Mescolare il liquido nel cono con un puntale, trasferirlo completamente in una microprovetta da 1,5 mL e centrifugare per 3 minuti a > 10.000 g.
3. Con un puntale eliminare tutto il surnatante.
4. Pipettare 700 µL di PBS sterile e risospendere il pellet con il vortex o pipettando su e giù. Centrifugare per 3 minuti a > 10.000 g.
5. Con un puntale eliminare tutto il surnatante. Ripetere il passo 4 ancora una volta (tampone di lavaggio e centrifugazione).
6. Con un puntale eliminare tutto il surnatante.

Lisi delle cellule:

7. Pipettare 100 µL di Lysis buffer nella provetta per microcentrifuga e risospendere il pellet con il vortex o pipettando su e giù. (Se il pellet non è completamente coperto, aumentare il volume di Lysis buffer, non oltre 200 µL.)
8. Aggiungere 3 µL di liticasi (15 U). (Aggiungere 3 µL di liticasi per ogni 100 µL di Lysis buffer aggiunti al passo 7.)
9. Agitare su vortex e incubare per 15 minuti a 37 °C.
10. Incubare per 10-15 minuti a 95-100 °C.
11. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.
12. Trasferire il surnatante limpido in una nuova provetta per microcentrifuga.
13. Usare subito il DNA o conservarlo a -20 °C se si vuole riutilizzarlo. Prima del riutilizzo omogeneizzare e centrifugare a > 10.000 g per 2 minuti.

Procedura 1: coltura di arricchimento

1. Concentrazione delle cellule: raccogliere 1 mL di terreno; > 10.000 x g, 5 min.
2. Lisi delle cellule: 100-200 µL di Lysis buffer; 95/100 °C, 10-15 min; > 10.000 x g, 5 min; prelevare il surnatante.

Procedura 2: colonie isolate

2. Lisi delle cellule: prelevare una piccola ansata di cellule; 100 µL di Lysis buffer; 95/100 °C, 10-15 min; > 10.000 x g, 5 min; prelevare il surnatante.

Procedura 3: DNA da bevande

1. Omogeneizzazione delle cellule: raccogliere 1-50 mL; velocità massima, 10 min; decantare il surnatante.
2. Lavaggio delle cellule: > 10.000 x g, 3 min; eliminare il surnatante; 700 µL di PBS; > 10.000 x g, 3 min; eliminare il surnatante; ripetere: 700 µL di PBS; > 10.000 x g, 3 min; eliminare il surnatante.
3. Lisi delle cellule: 100-200 µL di Lysis buffer; 3-6 µL di liticasi; 37 °C, 15 min; 95-100 °C, 10-15 min; > 10.000 x g, 5 min; usare il DNA direttamente o diluito.

Ogni lotto del kit è provato rispetto a specifiche predeterminate, per garantire una qualità costante del prodotto.

Il kit deve essere usato solo secondo le relative istruzioni per l'uso.

I componenti del kit sono destinati esclusivamente all'uso in vitro e solo a scopo di ricerca. I prodotti sono destinati solo all'uso generale di laboratorio.

Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione del DNA e l'amplificazione per PCR, richiedono personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati. Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in una sola direzione, dall'area di estrazione all'area di amplificazione e rilevazione. Non riportare campioni, attrezzature e reagenti nell'area in cui si è eseguito il passo precedente. L'utente deve sempre leggere tutte le istruzioni fornite con il prodotto prima di eseguire il saggio. Non mescolare reagenti di lotti diversi. Non usare reagenti di prodotti di altri produttori. Indossare guanti monouso e camici da laboratorio quando si manipolano campioni e reagenti. Usare puntali sterili con filtro. I rifiuti vanno trattati e smaltiti nel rispetto delle norme di sicurezza applicabili.