Cronobacter spp. qPCR Kit

La PCR è un metodo usato per amplificare una sequenza specifica di DNA in una reazione che contiene, tra gli altri componenti, una DNA polimerasi termostabile, nucleotidi e primer complementari alla sequenza bersaglio. Quando questa soluzione viene riscaldata, la molecola di DNA si denatura separandosi in due filamenti. Quando la soluzione si raffredda, i primer si appaiano alle sequenze bersaglio nei filamenti di DNA separati e la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento estendendo i primer con i nucleotidi, creando una copia della sequenza di DNA (ampliconi). La ripetizione di questo ciclo di denaturazione, appaiamento ed estensione aumenta in modo esponenziale il numero di ampliconi bersaglio. Nella real-time PCR il segnale si misura a ogni ciclo, nella maggior parte dei casi con sonde fluorescenti specifiche. La fluorescenza è misurata da un rilevatore e il software associato traccia l'intensità della fluorescenza in funzione del numero di cicli, permettendo di determinare la presenza o l'assenza dell'organismo bersaglio.

Cronobacter spp. è stato descritto in origine come Enterobacter cloacae a pigmentazione gialla, finché nel 1980 è stato definito Enterobacter sakazakii. Di recente è stato riclassificato come un nuovo genere, Cronobacter. Questo microrganismo è considerato un patogeno opportunista emergente trasmesso dagli alimenti, legato a casi clinici di infezione sia nei lattanti sia negli adulti. I sintomi clinici comprendono enterocolite necrotizzante, batteriemia e meningite, con alti tassi di mortalità nei neonati e nei lattanti. Le fonti di contaminazione, l'ecologia e le caratteristiche di virulenza di questo organismo sono ancora poco conosciute. Tuttavia, è stato isolato da un'ampia varietà di alimenti, tra cui formule per lattanti, latte in polvere, formaggio, verdure e carne. È stato ipotizzato che il latte in polvere e le formule per lattanti in polvere siano i veicoli responsabili del 50 %-80 % delle infezioni da Cronobacter. Di recente, altri metodi rapidi e sensibili si sono rivelati alternative interessanti al metodo colturale convenzionale per la rilevazione di Cronobacter spp. Si tratta di metodi basati sulla PCR, in particolare sulla real-time PCR, che permettono la rilevazione rapida di Cronobacter spp. nei campioni di alimenti.

I kit per la rilevazione dei patogeni comprendono un controllo interno (IC) nella master mix. Questo controllo viene amplificato insieme alla sequenza di DNA bersaglio, ma con un diverso set di primer e una sonda marcata con un fluoroforo diverso. L'inclusione dell'IC in ogni reazione permette di valutare gli inibitori della PCR nei risultati negativi.

Il kit è destinato alla rilevazione rapida di Cronobacter spp. in campioni di alimenti, dopo l'arricchimento in Buffered Peptone Water e l'estrazione del DNA. Il kit è stato validato sugli strumenti ABI PRISM 7500 Fast e PikoReal. Il kit è compatibile con tutti i termociclatori che lavorano nei canali FAM e ROX. Il kit di rilevazione non deve essere usato per procedure diagnostiche. Solo per uso nel settore alimentare.

La procedura comprende i seguenti passaggi principali:

1. Arricchimento del campione
2. Estrazione del DNA
3. Preparazione e corsa della PCR
4. Risultati e interpretazione

Il kit contiene i reagenti per 100 saggi.

Conservare tutti i componenti a -20 °C e proteggerli dalla luce, perché un'esposizione eccessiva alla luce può danneggiare le sonde fluorescenti. Ridurre al minimo i cicli di congelamento e scongelamento. I reagenti conservati come raccomandato si possono usare fino alla data di scadenza indicata sulla provetta.

• Microcentrifuga
• Cappe a flusso laminare/cappe per PCR
• Guanti in nitrile
• Micropipette e puntali con filtro privi di nucleasi
• Termociclatore real-time
• Provette/strip/piastre multipozzetto e accessori specifici per ogni strumento
• Tampone di lisi / kit di estrazione del DNA (per esempio: LC-6500, LC-6504, LC-6505, LC-6506, LC-6507)

Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione del DNA e l'amplificazione per PCR, richiedono personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati, dovuti soprattutto alla contaminazione dei campioni o alla degradazione degli acidi nucleici contenuti nei campioni. Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in una sola direzione, partendo dall'area di estrazione e passando all'area di amplificazione e rilevazione.

L'utente deve sempre fare attenzione a quanto segue:

• Leggere tutte le istruzioni fornite prima di eseguire il saggio.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Indossare DPI adeguati, compresi guanti monouso e camici da laboratorio.
• Conservare ed estrarre il materiale positivo separatamente da tutti gli altri reagenti.

In conformità alla ISO 9001, ogni lotto del kit è provato rispetto a specifiche predeterminate, per garantire una qualità costante del prodotto.

Arricchimento

Brodo e temperatura di prearricchimento secondo la norma ISO 22964, il Bacteriological Analytical Manual (BAM) (capitolo 29), per 18-24 h. Si possono usare anche altre procedure di arricchimento adatte e validate.

Estrazione del DNA

Usare un kit o un protocollo adatto per l'estrazione del DNA, come Complex Extraction Kit (LC-6500), Extraction Rapid (LC-6504, LC-6505) o Extraction Column (LC-6506, LC-6507).

Preparazione della PCR: miscela

Indossare sempre i guanti per tutte le procedure di PCR.

1. Scongelare le soluzioni del kit. Mescolare accuratamente e centrifugare brevemente.
2. Preparare le reazioni come descritto nella tabella qui sotto.
3. Mescolare la miscela preparata capovolgendo la provetta e centrifugare brevemente.
4. Distribuire aliquote da 18 µL di miscela preparata nei pozzetti della piastra o nelle provette per PCR.
5. Per il controllo negativo, pipettare 2 µL dalla provetta del controllo negativo (tappo trasparente); pipettare 2 µL di campione di DNA per pozzetto; per il controllo positivo, pipettare 2 µL dalla provetta del controllo positivo (tappo rosso). Ogni provetta o pozzetto di PCR deve avere un volume finale di PCR di 20 µL.
6. Centrifugare brevemente i pozzetti della piastra o le provette per PCR.
7. Mettere le reazioni nello strumento per real-time PCR.

Nota: preparare la reazione di PCR per ogni campione oppure, in alternativa, preparare una Master Mix per il numero totale di reazioni più il 10 %, per coprire le perdite di pipettamento (per esempio, per 10 campioni preparare un volume per 11). In questo caso, preparare la miscela in una provetta sterile da 1,5 mL, priva di nucleasi. Includere 2 reazioni di PCR per i controlli positivo e negativo.

Preparazione della PCR: programma

Impostare lo strumento per real-time PCR secondo il seguente programma di temperatura e tempo:

Per l'analisi dei risultati della PCR, selezionare le opzioni di visualizzazione della fluorescenza. I campioni con valori positivi del ciclo soglia (Ct) sono considerati positivi.

Importante: controllare anche le curve di amplificazione, non solo i valori di Ct. I campioni vanno esaminati sia in scala logaritmica sia in scala lineare e confrontati con il controllo negativo. Regolare la soglia (threshold), se necessario. La valutazione dei risultati dei campioni va fatta dopo aver esaminato i controlli positivo e negativo e averne verificato la validità. Se i risultati dei controlli non sono validi, i risultati dei campioni non si possono interpretare.

Interpretazione: controlli

Per validare il saggio, i controlli devono dare i seguenti risultati:

Se i controlli non corrispondono a questi risultati, l'esperimento va ripetuto.

Interpretazione: campioni

L'interpretazione dei risultati dei campioni è riassunta nella tabella seguente:

(1) Quando la rilevazione di Cronobacter spp. e quella dell'IC sono entrambe negative, nel campione sono presenti inibitori della PCR. Diluire il campione di DNA (diluizione 1/10) o eseguire un'altra estrazione del DNA e ripetere la qPCR.

(2) Un'alta concentrazione del DNA bersaglio nel campione può portare a un segnale di fluorescenza dell'IC ridotto o assente.

1. Esclusività del 100 %, determinata con 30 ceppi di organismi strettamente correlati o presenti nello stesso habitat.
2. Inclusività del 100 %, determinata su 2 ceppi di Cronobacter spp.

Dopo l'arricchimento si può raggiungere un limite di rilevazione da 1 a 10 cellule per 25 g di campione di alimento. Il kit rileva fino a 10³-10⁴ UFC/mL nelle colture di arricchimento. Il kit ha una sensibilità di reazione di 25 fg di DNA bersaglio.