STEC Screening qPCR Kit

La PCR è un metodo usato per amplificare una sequenza specifica di DNA in una reazione che contiene, tra gli altri componenti, una DNA polimerasi termostabile, nucleotidi e primer complementari alla sequenza bersaglio. Quando questa soluzione viene riscaldata, la molecola di DNA si denatura separandosi in due filamenti. Quando la soluzione si raffredda, i primer si appaiano alle sequenze bersaglio nei filamenti di DNA separati e la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento estendendo i primer con i nucleotidi, creando una copia della sequenza di DNA (ampliconi). La ripetizione di questo ciclo di denaturazione, appaiamento ed estensione aumenta in modo esponenziale il numero di ampliconi bersaglio. Nella real-time PCR il segnale si misura a ogni ciclo, nella maggior parte dei casi con sonde fluorescenti specifiche. La fluorescenza è misurata da un rilevatore e il software associato traccia l'intensità della fluorescenza in funzione del numero di cicli, permettendo di determinare la presenza o l'assenza dell'organismo bersaglio.

Escherichia coli, che fa parte del microbiota intestinale, può causare nell'uomo infezioni enteriche/diarroiche o extraintestinali. Gli E. coli enterici che causano malattia possono presentare diversi determinanti di virulenza, corrispondenti a diversi patotipi. Tra questi ci sono gli E. coli verocitotossigeni (VTEC), che comprendono gli E. coli enteroemorragici (EHEC), e gli E. coli enteropatogeni (EPEC). I VTEC sono caratterizzati dalla produzione di verocitotossine (Vtx), codificate dai geni vtx1 o vtx2 (note anche come tossine Shiga-like - Stx - corrispondenti ai geni stx1 e stx2). Gli EHEC sono un sottogruppo dei VTEC che, oltre ai geni che codificano le Vtx, portano il gene eae di adesione e cancellazione (che codifica l'intimina) e hanno la capacità di causare negli ospiti lesioni di adesione e cancellazione. Gli EPEC portano il gene eae ma non producono Vtx. I ceppi EHEC sono isolati tipicamente da casi di malattia grave come diarrea, colite emorragica (HC) e sindrome emolitico-uremica (HUS), potenzialmente fatale. Questi ceppi di E. coli, in particolare gli EHEC (compresi i sierotipi O157:H7 e O157:H-), sono riconosciuti come importanti patogeni responsabili di malattie trasmesse da alimenti nell'uomo. Si trasmettono soprattutto con carne bovina macinata poco cotta, latte pastorizzato in modo inadeguato, panini freddi, germogli e verdure. La necessità di metodi rapidi, accurati e sensibili per la rilevazione di questi ceppi di E. coli è una questione importante per la sicurezza alimentare. Poiché i metodi microbiologici convenzionali per la loro rilevazione e identificazione richiedono molto tempo, la PCR è stata introdotta nell'industria alimentare come metodo di rilevazione altamente sensibile e specifico.

I kit per la rilevazione dei patogeni comprendono un controllo interno (IC) nella master mix. Questo controllo viene amplificato insieme alla sequenza di DNA bersaglio, ma con un diverso set di primer e una sonda marcata con un fluoroforo diverso. L'inclusione dell'IC in ogni reazione permette di valutare gli inibitori della PCR nei risultati negativi.

Il kit è destinato alla rilevazione rapida di E. coli EPEC, VTEC ed EHEC in campioni di alimenti, dopo l'arricchimento in Buffered Peptone Water e l'estrazione del DNA. Si può usare anche con mangimi e campioni ambientali. Il kit è stato validato sugli strumenti ABI PRISM 7500 Fast e PikoReal. Il kit è compatibile con tutti i termociclatori che lavorano nei canali FAM e ROX. Il kit di rilevazione non deve essere usato per procedure diagnostiche. Solo per uso nel settore alimentare.

La procedura comprende i seguenti passaggi principali:

1. Arricchimento del campione
2. Estrazione del DNA
3. Preparazione e corsa della PCR
4. Risultati e interpretazione

Il kit contiene i reagenti per 50 saggi.

Conservare tutti i componenti a -20 °C e proteggerli dalla luce, perché un'esposizione eccessiva alla luce può danneggiare le sonde fluorescenti. Ridurre al minimo i cicli di congelamento e scongelamento. I reagenti conservati come raccomandato si possono usare fino alla data di scadenza indicata sulla provetta.

• Microcentrifuga
• Cappe a flusso laminare/cappe per PCR
• Guanti monouso senza talco
• Micropipette e puntali con filtro privi di nucleasi
• Strumento per real-time PCR
• Provette/strip/piastre multipozzetto e accessori specifici per ogni strumento
• Tampone di lisi / kit di estrazione del DNA (per esempio: LC-6500, LC-6504, LC-6505, LC-6506, LC-6507)

Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione del DNA e l'amplificazione per PCR, richiedono personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati, dovuti soprattutto alla contaminazione dei campioni o alla degradazione degli acidi nucleici contenuti nei campioni. Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in una sola direzione, partendo dall'area di estrazione e passando all'area di amplificazione e rilevazione.

L'utente deve sempre fare attenzione a quanto segue:

• Leggere tutte le istruzioni fornite prima di eseguire il saggio.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Indossare DPI adeguati, compresi guanti monouso e camici da laboratorio.
• Conservare ed estrarre il materiale positivo separatamente da tutti gli altri reagenti.

In conformità alla ISO 9001, ogni lotto del kit è provato rispetto a specifiche predeterminate, per garantire una qualità costante del prodotto.

Arricchimento

Si raccomanda un prearricchimento secondo ISO 16654:2001, BAM (capitolo 4a) o USDA, per 18-24 h. Si possono usare anche altre procedure di arricchimento adatte e validate.

Estrazione del DNA

Usare un kit o un protocollo adatto per l'estrazione del DNA, come Complex Extraction Kit (LC-6500), Extraction Rapid (LC-6504, LC-6505) o Extraction Column (LC-6506, LC-6507).

Preparazione della PCR: miscela

Indossare sempre i guanti per tutte le procedure di PCR.

1. Scongelare le soluzioni del kit. Mescolare accuratamente e centrifugare brevemente.
2. Preparare le reazioni come descritto nella tabella qui sotto.
3. Mescolare la miscela preparata capovolgendo la provetta e centrifugare brevemente.
4. Distribuire aliquote da 18 µL di miscela preparata nei pozzetti della piastra o nelle provette per PCR.
5. Per il controllo negativo, pipettare 2 µL dalla provetta del controllo negativo (tappo trasparente); pipettare 2 µL di campione di DNA per pozzetto; per il controllo positivo, pipettare 2 µL dalla provetta del controllo positivo (tappo rosso). Ogni provetta o pozzetto di PCR deve avere un volume finale di PCR di 20 µL.
6. Centrifugare brevemente i pozzetti della piastra o le provette per PCR.
7. Mettere le reazioni nello strumento per real-time PCR.

Nota: preparare la reazione di PCR per ogni campione oppure, in alternativa, preparare una Master Mix per il numero totale di reazioni più il 10 %, per coprire le perdite di pipettamento (per esempio, per 10 campioni preparare un volume per 11). In questo caso, preparare la miscela in una provetta sterile da 1,5 mL, priva di nucleasi. Includere 2 reazioni di PCR per i controlli positivo e negativo.

Preparazione della PCR: programma

Impostare lo strumento per real-time PCR secondo il seguente programma di temperatura e tempo:

Per l'analisi dei risultati della PCR, selezionare le opzioni di visualizzazione della fluorescenza. I campioni con valori di Ct positivi sono considerati positivi.

Importante: controllare anche le curve di amplificazione, non solo i valori di Ct. I campioni vanno esaminati sia in scala logaritmica sia in scala lineare e confrontati con il controllo negativo. Regolare la soglia (threshold), se necessario. La valutazione dei risultati dei campioni va fatta dopo aver esaminato i controlli positivo e negativo e averne verificato la validità. Se i risultati dei controlli non sono validi, i risultati dei campioni non si possono interpretare.

Interpretazione: controlli

Per validare il saggio, i controlli devono dare i seguenti risultati:

Se i controlli non corrispondono a questi risultati, l'esperimento va ripetuto.

Interpretazione: campioni

L'interpretazione dei risultati dei campioni è riassunta nella tabella seguente:

(1) Quando la rilevazione di E. coli e quella dell'IC sono entrambe negative, nel campione sono presenti inibitori della PCR. Diluire il campione di DNA (diluizione di 10 volte) o eseguire un'altra estrazione del DNA e ripetere la qPCR.

(2) Un'alta concentrazione del DNA bersaglio nel campione può portare a un segnale di fluorescenza dell'IC ridotto o assente.

Determinazione del patotipo

1. Esclusività del 100 %, determinata con 30 ceppi di organismi strettamente correlati o presenti nello stesso habitat.
2. Inclusività del 100 %, determinata su 18 campioni positivi per i geni eae, vtx1 e/o vtx2 di Escherichia coli.

Dopo l'arricchimento si può raggiungere un limite di rilevazione da 1 a 10 cellule per 25 g di campione di alimento. Il kit rileva fino a 10³-10⁴ UFC/mL nelle colture di arricchimento. Il kit ha una sensibilità di reazione di 25 pg di DNA bersaglio.