DNA Extraction Kit Column

La lisi avviene per shock termico e la purificazione con una serie di processi che eliminano i contaminanti e i residui cellulari. Il surnatante limpido viene poi mescolato con il Binding buffer, per creare le condizioni di legame ottimale alla colonnina con membrana di silice. Il DNA purificato è pronto all'uso per le reazioni successive, come la rilevazione e la quantificazione con real-time PCR.

Applicazioni

• DNA da matrici complesse, alimenti trasformati, alimenti crudi e mangimi, soia, cioccolato, cereali, carne
• Rilevazione di DNA specifico nei mangimi
• Rilevazione di materiale geneticamente modificato nei prodotti alimentari (OGM)
• Estrazione di DNA microbico
• Estrazione del DNA da tamponi e spugne
• DNA adatto a PCR, real-time PCR e reazioni enzimatiche

Se il kit è conservato correttamente, per la sua stabilità vedere la data di scadenza. TA: temperatura ambiente.

(1) Ricostituire la proteinasi K aggiungendo acqua priva di nucleasi (grado biologia molecolare) come indicato sulle fiale e conservarla a -20 °C. Si raccomanda di preparare diverse aliquote, per evitare cicli di scongelamento e congelamento. A questa temperatura è stabile per 1 anno.

(2) Prima dell'uso aggiungere etanolo (96-100 %) ai Wash buffer, come indicato sui flaconi. Tenere chiusi i contenitori, per evitare l'evaporazione dell'etanolo.

• Provette per microcentrifuga (1,5-2,0 mL; 15-50 mL)
• Micropipette e puntali con filtro per micropipette (10-100 µL e 100-1000 µL)
• Vortex
• Microcentrifuga in grado di arrivare a 10.000 g
• Blocco riscaldante (preferibilmente) o bagnomaria a 37 °C, da 65 ± 5 °C a 95 ± 5 °C
• Guanti senza talco
• Etanolo 100 %
• Kit di rilevazione in real-time PCR per allergeni o patogeni (facoltativi)

• Questi prodotti sono esclusivamente per uso in vitro.
• Il test richiede personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Non usare reagenti di prodotti di altri produttori.
• Indossare guanti monouso e camici da laboratorio quando si manipolano campioni e reagenti.
• Usare puntali sterili con filtro.
• Evitare il contatto di campioni e reagenti con pelle, occhi e mucose. In caso di contatto con queste soluzioni, sciacquare subito con acqua e consultare immediatamente un medico.
• Il Lysis buffer, il Binding buffer e il Wash buffer 1 contengono guanidina cloridrato, che a contatto con la candeggina (ipoclorito di sodio) può formare composti reattivi.
• Le schede di dati di sicurezza (MSDS) sono disponibili su richiesta.
• I rifiuti vanno trattati e smaltiti nel rispetto delle norme di sicurezza applicabili.
• Pulire periodicamente il piano di lavoro con ipoclorito di sodio almeno al 5 %.
• Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR.

Prima dell'uso mescolare leggermente il contenuto del kit.

In condizioni ambientali fredde, nel Lysis buffer si può formare un precipitato. In questo caso scaldare il componente per circa 5 minuti a 37 °C per sciogliere il precipitato e agitarlo bene prima dell'uso.

Preparazioni preliminari

Assicurarsi che la proteinasi K e i Wash buffer siano stati preparati come indicato nella sezione Contenuto e conservazione.

Preriscaldare il Lysis buffer e l'Elution buffer a 65-70 °C.

Procedura 1: isolamento del DNA da alimenti

(Per i prodotti lattiero-caseari vedere la procedura 2.)

Omogeneizzazione del campione:

1. Pesare circa 200 mg di materiale alimentare e trasferirlo in una provetta per microcentrifuga.

Per ottenere una buona resa è necessaria una buona omogeneizzazione del campione. La procedura di lisi è più efficace con campioni ben omogeneizzati. Si raccomanda la macinazione con pestello e mortaio o con omogeneizzatori commerciali.

Nei campioni liquidi usare direttamente 200 µL.

Per i prodotti lattiero-caseari vedere la procedura 2.

Lisi delle cellule:

2. Pipettare 1000 µL di Lysis buffer (preriscaldato) nella provetta per microcentrifuga e aggiungere 25 µL di proteinasi K. Agitare vigorosamente su vortex.
3. Centrifugare brevemente e incubare per 30 minuti a 65 °C. Agitare su vortex una o due volte durante l'incubazione (facoltativo).

Per i campioni ad alto contenuto di grassi (per esempio chorizo, formaggio, prosciutto ecc.) possono essere necessari una lisi overnight (O/N, 16-18 h a 65 °C) e il doppio della proteinasi K (50 µL).

4. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.

Legame del DNA:

5. Trasferire 500 µL di surnatante limpido in una nuova microprovetta con 250 µL di Binding buffer. Agitare brevemente su vortex.

In superficie può comparire uno strato di grasso. Per raccogliere un surnatante limpido, introdurre il puntale attraversando questo strato superficiale di grasso, cercando di prelevare solo il liquido surnatante colorato (ed evitando di toccare il pellet con il puntale).

6. Mettere la colonnina in una provetta di raccolta da 2 mL.
7. Trasferire 600 µL della miscela nella colonnina e centrifugare a > 10.000 g per 1 minuto. Eliminare il filtrato.
8. Ripetere il passo 7 per caricare il resto del campione.
9. Mettere la colonnina in una nuova provetta di raccolta.

Lavaggio:

10. Aggiungere 500 µL di Wash buffer 1 e centrifugare a > 10.000 g per 1 minuto. Eliminare il filtrato.
11. Aggiungere 700 µL di Wash buffer 2 e centrifugare a > 10.000 g per 1 minuto. Eliminare il filtrato.
12. Centrifugare a > 10.000 g per 3 minuti.

Eluizione:

13. Trasferire la colonnina in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e pipettare 100 µL di Elution buffer (preriscaldato a 70 °C) sulla membrana. Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.

Se si desidera una concentrazione di DNA più alta, ridurre il volume di Elution buffer (per esempio a 50 µL).

14. Centrifugare a > 10.000 g per 1 minuto. Eliminare la colonnina e usare subito il DNA o conservarlo a -20 °C.

Procedura 2: isolamento del DNA da prodotti lattiero-caseari

Prima di iniziare, preriscaldare il Lysis buffer e l'Elution buffer a 70 °C.

Omogeneizzazione del campione:

1. Omogeneizzare il campione alimentare e centrifugarne circa 50 mL a > 10.000 g per 10 minuti. Eliminare il surnatante.

Per ottenere una buona resa è necessaria una buona omogeneizzazione del campione. La procedura di lisi è più efficace con campioni ben omogeneizzati. Si raccomanda questa procedura per i campioni di prodotti lattiero-caseari come latte, burro e formaggio spalmabile o fiocchi di latte. Per gli altri tipi di formaggio, pesare 300 mg di materiale alimentare e passare direttamente al passo 4 di questa procedura.

2. Centrifugare per altri 10 minuti a > 10.000 g. Eliminare il surnatante.
3. Lavare il pellet con 1 mL di acqua priva di nucleasi o di PBS. Poi centrifugare per 3 minuti a > 10.000 g.
4. Pipettare 1000 µL di Lysis buffer (preriscaldato) nella provetta per microcentrifuga e aggiungere 50 µL di proteinasi K. Agitare vigorosamente su vortex.
5. Centrifugare brevemente e incubare per 30 minuti a 65 °C. Agitare su vortex una o due volte durante l'incubazione.

FACOLTATIVO: lisi overnight (O/N, 16-18 h a 65 °C).

6. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.
7. Proseguire con i passi di legame del DNA, lavaggio ed eluizione della procedura 1, isolamento del DNA da alimenti.

Procedura 3: isolamento del DNA batterico da coltura di arricchimento

Prima di iniziare, preriscaldare il Lysis buffer e l'Elution buffer a 70 °C.

Concentrazione:

1. Centrifugare 1 mL di terreno di pre-arricchimento o di arricchimento a > 10.000 g per 5 minuti. Eliminare il surnatante.

Evitare di trasferire residui di alimento dal terreno di arricchimento nella provetta per microcentrifuga.

Lisi delle cellule:

2. Pipettare 500 µL di Lysis buffer (preriscaldato) nella provetta per microcentrifuga. Agitare vigorosamente su vortex.
3. Centrifugare brevemente e incubare per 15 minuti a 95 °C.
4. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.
5. Proseguire con i passi di legame del DNA, lavaggio ed eluizione della procedura 1, isolamento del DNA da alimenti.

Procedura 4: isolamento del DNA da tamponi e spugne

Prima di iniziare, preriscaldare il Lysis buffer e l'Elution buffer a 70 °C.

Lisi delle cellule:

1. Mettere il tampone o la spugna in 1000 µL di Lysis buffer (preriscaldato) nella provetta per microcentrifuga e aggiungere 25 µL di proteinasi K. Agitare vigorosamente su vortex.
2. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore in agitazione.
3. Togliere il tampone o la spugna premendolo contro la parete della provetta, per recuperare tutto il campione.
4. Centrifugare brevemente e incubare per 30 minuti a 65 °C. Agitare su vortex una o due volte durante l'incubazione (facoltativo).
5. Centrifugare a > 10.000 g per 5 minuti.
6. Proseguire con i passi di legame del DNA, lavaggio ed eluizione della procedura 1, isolamento del DNA da alimenti.

Procedure 1 e 3: alimenti e coltura di arricchimento

1. Omogeneizzazione dell'alimento: omogeneizzare e pesare 200 mg di alimento (per le altre procedure vedere il protocollo completo).
2. Lisi delle cellule: 1000 µL di Lysis buffer + 25 µL di proteinasi K; 65 °C, 30 min (alimenti) oppure 500 µL di Lysis buffer, 95 °C, 15 min (batteri); > 10.000 x g, 5 min; prelevare 500 µL di surnatante e continuare con il passo 4.
3. Legame del DNA: 500 µL di surnatante (passo 3); 250 µL di Binding buffer; caricare la colonnina (max. 600 µL); > 10.000 x g, 1 min.
4. Lavaggio: 500 µL di Wash buffer 1, > 10.000 x g, 1 min; 700 µL di Wash buffer 2, > 10.000 x g, 1 min; > 10.000 x g, 3 min.
5. Eluizione del DNA: 100 µL di Elution buffer (preriscaldato a 70 °C); > 10.000 x g, 1 min.

Procedura 2: prodotti lattiero-caseari

1. Omogeneizzazione dell'alimento: omogeneizzare e pesare 50 mL di alimento (per ogni tipo di alimento vedere il protocollo completo).
2. Lavaggio del pellet: > 10.000 x g, 10 min; > 10.000 x g, 10 min; 1 mL di acqua priva di nucleasi (o PBS); > 10.000 x g, 3 min.
3. Lisi delle cellule: 1000 µL di Lysis buffer + 50 µL di proteinasi K, 65 °C, 30 min (alimenti); > 10.000 x g, 5 min; prelevare 500 µL di surnatante e continuare con il passo 4.
4. Legame del DNA: 500 µL di surnatante (passo 3); 250 µL di Binding buffer; caricare la colonnina (max. 600 µL); > 10.000 x g, 1 min.
5. Lavaggio: 500 µL di Wash buffer 1, > 10.000 x g, 1 min; 700 µL di Wash buffer 2, > 10.000 x g, 1 min; > 10.000 x g, 3 min.
6. Eluizione del DNA: 100 µL di Elution buffer (preriscaldato a 70 °C); > 10.000 x g, 1 min.

Ogni lotto del kit è provato rispetto a specifiche predeterminate, per garantire una qualità costante del prodotto.

Il kit deve essere usato solo secondo le relative istruzioni per l'uso.

I componenti del kit sono destinati esclusivamente all'uso in vitro e solo a scopo di ricerca. I prodotti sono destinati solo all'uso generale di laboratorio.

Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione del DNA e l'amplificazione per PCR, richiedono personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati. Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione del DNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in una sola direzione, dall'area di estrazione all'area di amplificazione e rilevazione. Non riportare campioni, attrezzature e reagenti nell'area in cui si è eseguito il passo precedente. L'utente deve sempre leggere tutte le istruzioni fornite con il prodotto prima di eseguire il saggio. Non mescolare reagenti di lotti diversi. Non usare reagenti di prodotti di altri produttori. Indossare guanti monouso e camici da laboratorio quando si manipolano campioni e reagenti. Usare puntali sterili con filtro. I rifiuti vanno trattati e smaltiti nel rispetto delle norme di sicurezza applicabili.