Lauryl Sulfate Broth (Lauryl Tryptose Broth - LTB) ISO

APHA raccomanda l'uso di Lauryl Tryptose Broth per la prova presuntiva dei coliformi con la tecnica del numero più probabile in acque, effluenti o liquami, anche come prova di conferma della fermentazione del lattosio con produzione di gas per i campioni di latte, e per la rilevazione dei coliformi negli alimenti. Questo brodo è stato formulato per favorire una crescita abbondante e un'elevata produzione di gas da piccoli inoculi di coliformi.

Lauryl Sulfate Broth è raccomandato dalle norme ISO 4831 e ISO 7251 per la rilevazione e la conta, rispettivamente, dei coliformi e di E. coli, con la tecnica del numero più probabile.

Il gruppo dei coliformi è sia aerobio sia anaerobio, Gram-negativo, non sporigeno, e fermenta il lattosio producendo acido e gas a 35 °C entro 48 ore.

Il triptosio alla concentrazione del 2 % migliora la fase iniziale di crescita dei coliformi rispetto al peptone di caseina. Il brodo tamponato permette ai microrganismi che fermentano lentamente il lattosio di aumentare la produzione di gas in un tempo più breve.

Il triptosio fornisce azoto, vitamine, minerali e aminoacidi essenziali per la crescita. Il lattosio è un carboidrato complesso fermentabile, fonte di energia. I fosfati di potassio sono gli agenti tampone e il cloruro di sodio fornisce gli elettroliti essenziali per il trasporto e l'equilibrio osmotico. Il lauril solfato di sodio è l'agente selettivo usato per inibire i microrganismi diversi dai coliformi. I batteri aerobi sporigeni sono completamente inibiti.

Preparazione

Sospendere 35,6 grammi di terreno in un litro di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. Distribuire in provette con campanelle di Durham per la raccolta e la rilevazione del gas. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Secondo ISO 4831

Per la rilevazione e la conta dei coliformi secondo ISO 4831:

1. Inoculare le provette di brodo di arricchimento selettivo (Lauryl Tryptose Broth) con la porzione da analizzare.
2. Per inoculi di 1 mL o meno, usare il terreno LTB a concentrazione singola.
3. Per inoculi di 10 mL o più, usare il terreno LTB a doppia concentrazione.
4. Incubare a 30 °C o a 37 °C (come concordato) per 24 h (terreno a doppia concentrazione) oppure per 24 h e altre 24 h se a questo punto non si osservano né formazione di gas né un'opacità che impedisca di rilevare la formazione di gas (terreno a concentrazione singola).
5. Dalle provette incubate di LTB a doppia concentrazione e dalle provette incubate di LTB a concentrazione singola che mostrano formazione di gas o opacità, inoculare una provetta di terreno di conferma (Brilliant Green Bile Broth 2%, LC-1228) e osservare dopo 24 o 48 h.
6. Una provetta con formazione di gas è una provetta positiva.
7. Contare il numero totale di provette positive.

Secondo ISO 7251

Per la rilevazione e la conta di E. coli presunto secondo ISO 7251:

1. Inoculare le provette di brodo di arricchimento selettivo (Lauryl Tryptose Broth) con la sospensione iniziale.
2. Per inoculi di 1 mL o meno, usare il terreno LTB a concentrazione singola.
3. Per inoculi di 10 mL o più, usare il terreno LTB a doppia concentrazione.
4. Incubare le provette di LTB a 37 °C fino a 48 h ed esaminare la produzione di gas dopo 24 h e 48 h.
5. Ogni provetta di LTB a doppia concentrazione che ha dato opacità, torbidità o emissione di gas, e ogni provetta di LTB a concentrazione singola che ha dato emissione di gas, si trapianta in una provetta contenente EC Broth (LC-1522).
6. Incubare le provette di EC Broth a 44 °C fino a 48 h ed esaminare la produzione di gas dopo 24 h e 48 h.
7. Ogni provetta di EC Broth che ha dato emissione di gas si trapianta in una provetta contenente Indole-Free Peptone Water (LC-1403) e si incuba a 44 °C per 48 h.
8. Le provette che mostrano opacità, torbidità o produzione di gas in LTB e i cui trapianti hanno prodotto gas in EC Broth e indolo in Peptone Water si considerano provette positive contenenti E. coli presunto.
9. Contare gli E. coli totali con il metodo MPN.

• ISO 4831 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms - Most probable number technique.
• APHA 1998. Standard Methods for the examination of water and wastewater, 20th Edition.
• Association of Official Analytical Chemists. 1995. Bacteriological analytical manual, 8th ed. AOAC International, Gaithersburg, MD.
• Association of Official Analytical Chemists. 1995. Official methods of analysis of AOAC International, 16th ed. AOAC International, Arlington, VA.
• ISO 7251 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli - Most probable number technique.