Swine Species ID qPCR Kit

Secondo la Direttiva 2002/86/CE della Commissione europea, gli ingredienti alimentari devono essere dichiarati. L'autenticità della specie è molto importante per i consumatori, per motivi economici, medici, culturali e religiosi. Esempi come la sostituzione fraudolenta di specie costose con carni più economiche, l'inclusione di carne in prodotti vegetariani e gli allergeni nei prodotti alimentari mettono in evidenza l'importanza di questo tema. Inoltre, le specie di carne devono essere indicate in etichetta con la denominazione commerciale e con quella scientifica, per verificare l'origine e la tracciabilità della carne e per analizzare il controllo qualità dei processi di manipolazione e di pulizia delle linee di produzione.

I metodi per la rilevazione delle specie basati sull'identificazione delle proteine non sono affidabili per l'applicazione su prodotti molto trasformati e riscaldati, a causa del deterioramento delle proteine. Il DNA è più stabile delle proteine durante la lavorazione. I metodi di rilevazione tradizionali basati sulle proteine non sono affidabili per i prodotti molto trasformati e riscaldati, a differenza dei metodi basati sul DNA. Il DNA è più stabile, e le moderne tecniche di PCR permettono di identificare il DNA frammentato delle specie presenti in un campione, garantendo una rilevazione accurata e molto sensibile, con un limite di rilevazione più basso. Le tecniche di real-time PCR sono adatte ad amplificare piccoli frammenti di DNA con alta sensibilità e specificità.

Il kit comprende un controllo interno (IC). L'IC serve a valutare gli inibitori della PCR nel campione o i problemi verificatisi durante la preparazione/amplificazione della PCR. Il kit comprende una master mix per il bersaglio e l'IC, primer e sonde TaqMan marcate con quencher non fluorescenti. Il kit contiene uracil-DNA glicosilasi (UDG), che previene la contaminazione del DNA con i prodotti di PCR. Il kit comprende un controllo positivo, che permette di valutare i primer e le sonde usati per rilevare i bersagli, e un controllo negativo (acqua priva di nucleasi) per confermare l'integrità dei reagenti del kit.

Il kit è compatibile con tutti i termociclatori che lavorano nei canali FAM e ROX. Il kit di rilevazione non deve essere usato per procedure diagnostiche. Solo per uso nel settore alimentare.

La procedura comprende i seguenti passaggi principali:

1. Trattamento del campione
2. Estrazione del DNA
3. Preparazione e corsa della PCR
4. Risultati e interpretazione

In conformità alla ISO 9001, ogni lotto del kit è provato rispetto a specifiche predeterminate, per garantire una qualità costante del prodotto.

Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione per PCR, richiedono personale qualificato per evitare il rischio di risultati errati, dovuti soprattutto alla contaminazione dei campioni o alla degradazione degli acidi nucleici contenuti nei campioni. Si raccomanda vivamente di avere aree, materiali e attrezzature dedicati per l'estrazione dell'RNA, la preparazione della PCR e le procedure post-PCR. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in una sola direzione, partendo dall'area di estrazione e passando all'area di amplificazione e rilevazione.

L'utente deve sempre fare attenzione a quanto segue:

• Leggere tutte le istruzioni fornite prima di eseguire il saggio.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Indossare DPI adeguati, compresi guanti monouso e camici da laboratorio.
• Conservare ed estrarre il materiale positivo separatamente da tutti gli altri reagenti.

Il kit va conservato tra -20 °C e 5 °C e protetto dall'esposizione alla luce. Evitare scongelamenti e congelamenti ripetuti (> 5), perché possono ridurre la sensibilità. Valutare il congelamento in aliquote, per mantenere le prestazioni del saggio.

Il kit contiene i reagenti per 100 reazioni.

• Microcentrifuga
• Cappe a flusso laminare/cappe per PCR
• Guanti monouso senza talco
• Micropipette e puntali con filtro privi di nucleasi
• Strumento per real-time PCR
• Provette/strip/piastre multipozzetto e accessori specifici per ogni strumento
• Kit di estrazione del DNA

Preparazione del campione

A seconda delle caratteristiche specifiche del campione, prima dell'estrazione del DNA possono essere necessarie procedure come l'omogeneizzazione e la macinazione.

Estrazione del DNA

Usare un kit o un protocollo adatto per l'estrazione del DNA, come Complex Extraction Kit (LC-6500), Extraction Rapid (LC-6504, LC-6505) o Extraction Column (LC-6506, LC-6507).

Preparazione della PCR: miscela

Indossare sempre i guanti per tutte le procedure di PCR.

1. Scongelare le soluzioni del kit. Mescolare accuratamente (non agitare su vortex la provetta Enzimi) e centrifugare brevemente.
2. Preparare le reazioni come descritto nella tabella qui sotto.
3. Mescolare la miscela preparata capovolgendo la provetta e centrifugare brevemente.
4. Distribuire aliquote da 15 µL di miscela preparata nei pozzetti della piastra o nelle provette per PCR.
5. Per il controllo negativo, pipettare 5 µL dalla provetta del controllo negativo (tappo trasparente); pipettare 5 µL di campione di DNA per pozzetto; per il controllo positivo, pipettare 5 µL dalla provetta del controllo positivo (tappo rosso). Ogni provetta o pozzetto di PCR deve avere un volume finale di PCR di 20 µL.
6. Centrifugare brevemente i pozzetti della piastra o le provette per PCR.
7. Mettere le reazioni nello strumento per real-time PCR.

Nota: preparare la reazione di PCR per ogni campione oppure, in alternativa, preparare una Master Mix per il numero totale di reazioni più il 10 % (per esempio, per 10 campioni preparare un volume per 11). In questo caso, preparare la miscela in una provetta sterile da 1,5 mL, priva di nucleasi. Includere 2 reazioni di PCR per i controlli positivo e negativo.

Preparazione della PCR: programma

Impostare lo strumento per real-time PCR secondo il seguente programma di temperatura e tempo:

Per l'analisi dei risultati della PCR, selezionare le opzioni di visualizzazione della fluorescenza. I campioni con valori di Ct positivi sono considerati positivi.

Importante: controllare anche le curve di amplificazione, non solo i valori di Ct. I campioni vanno esaminati sia in scala logaritmica sia in scala lineare e confrontati con il controllo negativo. Regolare la soglia (threshold), se necessario. La valutazione dei risultati dei campioni va fatta dopo aver esaminato i controlli positivo e negativo e averne verificato la validità. Se i risultati dei controlli non sono validi, i risultati dei campioni non si possono interpretare.

Interpretazione: controlli

Per validare il saggio, i controlli devono dare i seguenti risultati:

Se i controlli non corrispondono a questi risultati, l'esperimento va ripetuto.

Interpretazione: campioni

L'interpretazione dei risultati dei campioni è riassunta nella tabella seguente:

(1) Quando la rilevazione del suino e quella dell'IC sono entrambe negative, nel campione sono presenti inibitori della PCR. Diluire il campione o eseguire un'altra estrazione del DNA.

(2) Un'alta concentrazione del DNA bersaglio nel campione può portare a un segnale di fluorescenza dell'IC ridotto o assente.

1. Esclusività del 100 %, determinata con DNA di specie non bersaglio, di specie animali che possono essere presenti negli stessi prodotti alimentari (tabelle 1, 2).
2. Inclusività del 100 %, determinata su campioni alimentari ottenuti da diverse fonti commerciali e dal controllo qualità esterno (Tabella 3). All'interno del genere Sus, il kit rileva anche la specie Sus scrofa (cinghiale).

Tabella 1: campioni alimentari analizzati per la validazione del kit

Tabella 2: elenco delle specie usate per l'esclusività del kit

Tabella 3: sensibilità analitica del kit

Sensibilità analitica: 95 %.

Il limite di rilevazione (LoD) del kit è 10 pg di DNA bersaglio. Il limite di rilevazione del metodo permette di rilevare lo 0,02 % di DNA di suino (Sus domesticus) in 50 ng di DNA totale. Non si sono ottenuti falsi negativi, né nelle condizioni di PCR definite né nelle deviazioni usate per la robustezza, con aumento della stringenza.