T.S.C. Agar Base (Tryptose Sulfite Cycloserine) ISO

La base nutritiva superiore offre condizioni ottimali per lo sviluppo dei clostridi. Il triptosio e il peptone di soia forniscono azoto, vitamine, minerali e aminoacidi essenziali per la crescita. L'estratto di lievito è fonte di vitamine, in particolare del gruppo B, essenziali per la crescita batterica. Il citrato ferrico ammonico e il disolfito disodico sono indicatori di H₂S. L'agar batteriologico è l'agente solidificante. La cicloserina inibisce la flora batterica di accompagnamento e può far restare più piccole le colonie che si sviluppano.

Le colonie che producono idrogeno solforato si riconoscono da un annerimento dovuto alla reazione con il sale ferrico. La degradazione della lecitina del tuorlo d'uovo dà prodotti insolubili che si accumulano intorno alle colonie, formando un precipitato bianco. Dopo 24 ore di incubazione, tutte le colonie nere, sia lecitinasi positive sia lecitinasi negative, vanno considerate C. perfringens presunti positivi e vanno eseguite le relative prove di conferma.

Preparazione

Sospendere 42 grammi di terreno in un litro di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Raffreddare il terreno secondo la norma applicabile e aggiungere in condizioni asettiche due fiale di Clostridium perfringens Selective Supplement (LC-6020). Se si desidera, si possono aggiungere 25 mL di Egg Yolk Emulsion Supplement (LC-5152) (non indicato nella norma ISO). Omogeneizzare delicatamente e distribuire in piastre di Petri.

Secondo ISO 7937

Conta di Clostridium perfringens negli alimenti secondo ISO 7937:

1. Trasferire 1 mL della sospensione iniziale nelle piastre di Petri vuote.
2. Versare nella piastra da 10 a 15 mL di TSC Agar (44-47 °C) e mescolare con l'inoculo ruotando delicatamente ogni piastra. Quando il terreno si è solidificato, aggiungere uno strato superiore di 10 mL di TSC agar.
3. Incubare in anaerobiosi a 37 °C per 20 ± 2 ore.
4. Dopo 24 ore di incubazione, tutte le colonie nere, sia lecitinasi positive sia lecitinasi negative, vanno considerate C. perfringens presunti positivi e vanno eseguite le relative prove di conferma.

Secondo ISO 14189

Conta di Clostridium perfringens nei campioni di acqua secondo ISO 14189:

1. Filtrare un volume misurato di acqua, tale da ottenere 10-80 colonie sulla membrana.
2. Porre la membrana su una piastra di TSC Agar.
3. Incubare le piastre con i filtri, capovolte, in anaerobiosi a 44 ± 1 °C per 21 ± 3 ore.
4. Dopo 24 ore di incubazione, tutte le colonie nere, sia lecitinasi positive sia lecitinasi negative, vanno considerate C. perfringens presunti positivi e vanno eseguite le relative prove di conferma.

• Sahidi S.A. and Ferguson A.R. (1971) Appl. Microbiol, 21 500-506.
• Harmon S.M., Kauttar D.A. and Peeler J.T. (1971) Appl. Microbiol. 21 922-927.
• Hauschild A.H.W. and Hilsheimar R. (1973) Appl. Microbiol. 27. 78-82.
• International standard ISO 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for enumeration of Clostridium perfringens - colony count technique
• International standard ISO 14189 Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane filtration