Listeria Chromogenic Agar Base acc. to Ottaviani&Agosti (ALOA) ISO

Il digerito enzimatico di tessuti animali e il digerito enzimatico di caseina forniscono azoto, vitamine, minerali e aminoacidi essenziali per la crescita. L'estratto di lievito è la fonte di vitamine, in particolare del gruppo B. Il cloruro di sodio fornisce gli elettroliti essenziali per il trasporto e l'equilibrio osmotico. Il piruvato di sodio è una fonte di energia per il metabolismo batterico e aiuta la rivitalizzazione dei microrganismi stressati. Il glucosio è il carboidrato fermentabile che fornisce carbonio ed energia. Il glicerofosfato di magnesio è un composto tampone. Il solfato di magnesio è uno ione magnesio necessario per una grande varietà di reazioni enzimatiche, compresa la replicazione del DNA. L'attività differenziale del terreno è dovuta a due fattori. Il cloruro di litio del terreno di base e i composti antimicrobici supplementari, ceftazidima, polimixina, acido nalidixico e cicloesimide, conferiscono selettività al terreno. L'agar batteriologico è l'agente solidificante.

La presenza del componente cromogenico X-glucoside, substrato per la rilevazione dell'enzima beta-glucosidasi, comune a tutte le specie di Listeria, dà alle colonie il loro colore blu. Gli altri microrganismi che possiedono questo enzima, per esempio gli enterococchi, sono inibiti dagli agenti selettivi del terreno e dal supplemento selettivo. L'attività differenziale si ottiene anche con il substrato della lipasi C, su cui agisce l'enzima specifico di L. monocytogenes. La lipasi è responsabile dell'alone bianco opaco che circonda L. monocytogenes.

La combinazione dei due substrati permette di differenziare le colonie di Listeria monocytogenes dalle altre Listeria spp. perché, anche se tutte sono di colore blu, quelle di L. monocytogenes presentano un alone bianco opaco che le circonda.

Si è osservato che anche alcuni ceppi di Listeria ivanovii, patogeni soprattutto per gli animali anche se alcuni hanno causato infezioni nell'uomo, possiedono attività lipasica.

Formula tipica in g/L, adattata e/o integrata secondo necessità per soddisfare i criteri di prestazione.

Preparazione

Sospendere 35,275 grammi di terreno in 470 mL di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Per preparare quantità superiori a 500 mL, si raccomanda di sterilizzare a 115 °C per 10 minuti. Raffreddare a 47-50 °C e aggiungere in condizioni asettiche un flacone di Listeria Lipase C Supplement (24 mL) (LC-6031) e una fiala di Listeria Chromogenic Selective Supplement (LC-6040). Omogeneizzare delicatamente e distribuire in piastre di Petri.

Secondo ISO 11290

Rilevazione e conta di Listeria monocytogenes e Listeria spp. secondo ISO 11290.

Metodo di rilevazione:

1. Pesare 25 g (o 25 mL) di campione e aggiungere 225 mL di Half Fraser Broth (LC-1183). Omogeneizzare e incubare a 30 °C per 25 ± 1 ore.
2. Inoculare 0,1 mL della coltura incubata in Half Fraser Broth (qualunque sia il suo colore) in 10 mL di Fraser Broth (LC-1182). Incubare a 37 °C per 24 ± 2 ore in aerobiosi.
3. Dalla coltura di arricchimento primario, inoculare la superficie di Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti e dell'altro terreno selettivo scelto dal laboratorio, per ottenere colonie ben separate. Dalla coltura di arricchimento secondario, ripetere la procedura: inoculare la superficie di Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti e dell'altro terreno selettivo. Per Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti, incubare per un totale di 48 ± 2 h.
4. Selezionare le colonie presuntive ed eseguire le prove di conferma per L. monocytogenes o Listeria spp.

Metodo di conta:

1. Preparare una sospensione iniziale 1:10 di campione e Buffered Peptone Water per l'analisi. Listeria 1/2 Fraser Broth (LC-1183) si può usare come diluente se le procedure di rilevazione e di conta si eseguono contemporaneamente.
2. Inoculare 0,1 mL sulla superficie di Listeria Chromogenic Agar according to Ottaviani and Agosti.
3. Incubare a 37 °C per 24 ± 2 h. Se non si osserva crescita microbica, incubare per altre 24 ore.
4. Selezionare le colonie presuntive ed eseguire le prove di conferma per L. monocytogenes o Listeria spp.
5. Calcolare dalle colonie confermate il numero di colonie di L. monocytogenes o di Listeria spp.

• Ottaviani, F., Ottaviani, M. and Agosti, M (1987) Quimper Froid Symposium Proceedings, P6 A.D.R.I.A Quimper (F) 16-18 June.
• ISO 11290 Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes.