Tryptophan Culture Broth ISO

Il triptone fornisce azoto, vitamine, minerali e aminoacidi essenziali per la crescita. Il cloruro di sodio fornisce gli elettroliti essenziali per il trasporto e l'equilibrio osmotico. L'assenza di carboidrati fermentabili nel terreno permette una buona sintesi della triptofanasi e quindi la produzione di indolo.

Preparazione

Sospendere 16 grammi di terreno in un litro di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. Distribuire in provette, 3 mL in ognuna. Chiudere le provette con cotone o con un tappo di plastica o di metallo e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Istruzioni per l'uso

Per la rilevazione e la conta di Escherichia coli e dei batteri coliformi nei campioni di acqua:

1. Filtrare un volume adatto di campione attraverso la membrana.
2. Porre la membrana sulla superficie di una piastra di TTC Chapman Agar (LC-1076), evitando la formazione di bolle d'aria.
3. Capovolgere le piastre e incubare a 36 ± 2 °C per 21 ± 3 ore.
4. Contare come batteri lattosio-positivi le colonie che presentano uno sviluppo giallo del terreno sotto la membrana.
5. Trapiantare le colonie caratteristiche ottenute in agar non selettivo e in Tryptophan Culture Broth.
6. Eseguire la prova dell'ossidasi e incubare le provette di Tryptophan Culture Broth a 44 ± 0,5 °C per 21 ± 3 ore.
7. La produzione di indolo si determina aggiungendo qualche goccia di Kovac's Reagent (LC-5205) alle provette incubate di Tryptophan Culture Broth. Una prova positiva è indicata dalla comparsa di un colore rosso nello strato del reagente.
8. Le colonie ossidasi negative saranno considerate batteri coliformi e le colonie ossidasi negative e indolo positive saranno considerate E. coli.

Per la rilevazione di Escherichia coli O157 secondo ISO 16654:

1. Preparare la sospensione iniziale aggiungendo la porzione da analizzare a Trypticasein Soy Broth Modified with Novobiocin (LC-1292), preriscaldato a 41,5 °C, per ottenere un rapporto di 1/10.
2. Separare e concentrare i microrganismi con particelle immunogeniche rivestite di anticorpi anti E. coli O157.
3. Incubare per 6 ore, poi per altre 12-18 ore a 41,5 °C.
4. Trapiantare le particelle immunomagnetiche con i batteri adesi su MacConkey Agar with Sorbitol (LC-1099) e su un secondo agar di isolamento selettivo scelto dal laboratorio. La temperatura di incubazione ottimale per E. coli O157 è 37 ± 1 °C per 18-24 ore.
5. Confermare con la produzione di indolo in Tryptophan Culture Broth e con l'agglutinazione con il siero anti E. coli O157.

• ISO 9308-1. Water quality - Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria. Part 1: Membrane filtration method.
• ISO 16654:2001 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157.