M-CC Broth

Descrizione

La selettività è ottenuta, in parte, con Tergitol 7, che inibisce la crescita dei batteri Gram-positivi e di alcuni Gram-negativi senza influire sui batteri coliformi. La selettività è aumentata dalla cefsulodina e dalla vancomicina, che agiscono contro Pseudomonas e i batteri Gram-negativi ossidasi-positivi, gli enterococchi e gli altri batteri Gram-positivi.

La differenziazione delle colonie è dovuta alla miscela cromogenica, composta da due substrati enzimatici: 6-cloro-3-indossil-beta-D-galattopiranoside (Salmon-GAL) e 5-bromo-4-cloro-3-indossil-beta-D-glucuronide (X-Glucuronide).

Il primo è scisso dall'enzima caratteristico dei coliformi, la beta-D-galattosidasi, e dà alle colonie di coliformi un colore rosso salmone. La seconda sostanza cromogenica è scissa dall'enzima beta-D-glucuronidasi, caratteristico di E. coli, e colora di blu le colonie di questi batteri.

E. coli possiede i due enzimi e scinde entrambe le sostanze cromogeniche, dando colonie da blu scuro a viola. I coliformi totali sono la somma delle colonie di E. coli e delle colonie rosso salmone.

Gli altri batteri Gram-negativi producono colonie incolori, tranne alcuni che hanno attività glucuronidasica (ma non galattosidasica) e producono colonie da azzurro a turchese.

Per confermare le colonie di E. coli, nel terreno è inclusa una piccola quantità di triptofano che permette di verificare la produzione di indolo: coprire le colonie blu-viola con una goccia di Kovac's Reagent. Se in pochi secondi il reattivo diventa rosso ciliegia, è confermata la produzione di indolo e quindi la presenza di E. coli.

Quando Chromogenic Agar for Coliform si usa con il metodo della membrana filtrante, il colore e la crescita delle colonie possono essere modificati dalle caratteristiche della membrana filtrante. È consigliabile eseguire una validazione del tipo di membrana filtrante usato.

Il Ministero della Sanità spagnolo (Ministerio de Sanidad y Consumo) ha adottato ufficialmente questo terreno come metodologia alternativa per l'analisi microbiologica delle acque destinate al consumo umano, dando una nuova definizione di Escherichia coli ("Enterobacteriaceae che esprimono contemporaneamente gli enzimi beta-D-galattosidasi e beta-D-glucuronidasi") e dei batteri coliformi ("Enterobacteriaceae che esprimono l'enzima beta-D-galattosidasi").

Tecnica

Se si usa il metodo della filtrazione su membrana (MF) per concentrare il campione, impregnare un cuscinetto sterile con il terreno e appoggiare la membrana filtrante sul cuscinetto. Incubare per 21-24 ore a 36 ± 2 °C. Se a 18 h c'è crescita di colonie rosse o incolori, prolungare l'incubazione fino a 24 h per includere le reazioni tardive della beta-galattosidasi o della beta-glucuronidasi. Contare le colonie beta-galattosidasi positive e beta-glucuronidasi negative (tutte le colonie di colore da rosa salmone a rosso) come batteri coliformi diversi da E. coli.

Contare le colonie beta-galattosidasi positive e beta-glucuronidasi positive (tutte le colonie di colore da blu intenso a viola) come E. coli. La conta dei coliformi totali si ottiene sommando le colonie da rosa salmone a rosso e le colonie da blu intenso a viola. Calcolare la concentrazione dei batteri coliformi e di E. coli in 100 mL dal volume iniziale di acqua filtrata e dal numero di colonie caratteristiche contate sulla membrana. I risultati si esprimono in unità formanti colonia per millilitro (UFC/mL).

Secondo le norme interne o le metodologie di ogni laboratorio, la temperatura e il tempo di incubazione possono variare.

Controllo fisico-chimico

Controllo microbiologico

Filtrazione su membrana / intervallo pratico 100 ± 20 UFC, minimo 50 UFC (produttività) / 10⁴-10⁶ UFC (selettività) / ≥ 10³ UFC (specificità).

Cuscinetto impregnato con il terreno di coltura.

Aerobiosi. Incubazione a 36 ± 2 °C, lettura a 21-24 h.

Controllo di sterilità

Incubazione 48 ore a 30-35 °C e 48 ore a 20-25 °C: NESSUNA CRESCITA.

Controllo a 7 giorni dopo l'incubazione nelle stesse condizioni.

• ADAMS, M., R. GRUBB, S.M. HAMER & A. CLIFFORD (1990) Colorimetric enumeration of Escherichia coli based on beta-glucuronidase activity. Appl. Environ. Microbiol. 56:2021.
• ISO 7704 Standard (1985) Water Quality - Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses.
• ISO/DIS 9308-1 Standard (2014)/Amd.1:2016 Water quality. Detection and enumeration of E. coli and coliform bacteria, Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora.
• KILIAN, M. & P. BÜLOW (1976) Rapid Diagnostic of Enterobacteriaceae. I. Detection of bacterial glycosidases. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B 84:245-251.
• MANAFI, M. & W. KNEIFEL (1989) A combined chromogenic-fluorogenic medium for the simultaneous detection of total coliform and E. coli in water. Zentralbl. Hyg. 189:225-234.
• MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO (2009) Orden SCO/778/2009 de 17 de marzo sobre métodos alternativos para el análisis microbiológico del agua de consumo humano. BOE. n.º 78 de 31-04-2009. Sección I, Págs. 30417-30420. Madrid.