Violet Red Bile Agar With Lactose (VRBL) ISO

Il peptone fornisce azoto, vitamine, minerali e aminoacidi essenziali per la crescita. L'estratto di lievito è fonte di vitamine, in particolare del gruppo B. Il lattosio è il carboidrato fermentabile che fornisce carbonio ed energia. I sali biliari e il cristal violetto inibiscono i batteri Gram-positivi. Il rosso neutro è un indicatore di pH. Il cloruro di sodio fornisce gli elettroliti essenziali per il trasporto e l'equilibrio osmotico. L'agar batteriologico è l'agente solidificante.

Conviene usare il metodo per inclusione.

I microrganismi che fermentano il lattosio formano colonie rosse con aloni rosso porpora. Talvolta i cocchi del tratto intestinale possono svilupparsi come piccole colonie rosse puntiformi. Le colonie rosso violacee (talvolta circondate da una zona rossastra di bile precipitata) sono considerate colonie tipiche di coliformi e non richiedono ulteriore conferma.

Le colonie atipiche (per esempio di dimensioni minori) e tutte le colonie derivate da prodotti a base di latte che contengono zuccheri diversi dal lattosio possono dare colonie di aspetto simile a quello dei coliformi tipici. Queste colonie vanno confermate in provette di Brilliant Green Bile Broth (LC-1228).

Preparazione

Sospendere 41,5 grammi di terreno in un litro di acqua distillata. Mescolare bene e sciogliere scaldando e agitando spesso. Far bollire per un minuto fino a completa dissoluzione. NON SURRISCALDARE. Raffreddare a 44-47 °C e usare subito.

Secondo ISO 4832

Per la conta dei coliformi secondo ISO 4832:

1. Si raccomanda di preparare due piastre per il prodotto liquido e/o per ogni diluizione scelta.
2. Con una pipetta sterile trasferire 1 mL di prodotto liquido o delle diluizioni appropriate al centro di ogni piastra. Usare un'altra pipetta sterile per inoculare ogni diluizione nelle piastre.
3. Versare in ogni piastra di Petri circa 15 mL di terreno VRBL, a una temperatura da 44 °C a 47 °C. Il tempo che trascorre tra la fine della preparazione della sospensione iniziale (o della diluizione 10⁻¹, se il prodotto è liquido) e il momento in cui il terreno viene versato nelle piastre non deve superare 15 min.
4. Mescolare con cura l'inoculo con il terreno e lasciar solidificare la miscela con le piastre di Petri appoggiate su una superficie orizzontale fresca.
5. Preparare anche una piastra di controllo con il terreno, per verificarne la sterilità.
6. Dopo la completa solidificazione, versare circa 4 mL di terreno VRBL, a una temperatura da 44 °C a 47 °C, sulla superficie del terreno inoculato. Lasciar solidificare come descritto sopra.
7. Capovolgere le piastre preparate e incubarle nell'incubatore impostato a 30 °C o a 37 °C (come concordato) per 24 ± 2 h.
8. Per confermare le colonie presuntive di coliformi, inoculare cinque colonie di ogni tipo atipico, se disponibili, in provette di Brilliant Green Lactose Bile Broth (LC-1228).
9. Incubare le provette nell'incubatore impostato a 30 °C o a 37 °C (come concordato) per 24 ± 2 ore.
10. Considerare coliformi le colonie che mostrano formazione di gas nella campanella di Durham.

• ISO 4832. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique.
• Collins, J. Milk and Food Tech 18:169, 1955.
• Hartman, J. Milk and Food Tech 23:43. 1960.
• Speck, M.L. (ed) 1976. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA).