Legionella Agar GVPC ISO

Descrizione

Il terreno è composto da un terreno base integrato con fattori di crescita (BCYE Agar) e dal terreno selettivo integrato con inibitori della flora accompagnatrice indesiderata. L'estratto di lievito fornisce i nutrienti di base, perché il terreno non contiene carboidrati fermentabili. La L-cisteina, il pirofosfato ferrico e l'alfa-chetoglutarato sono aggiunti per soddisfare le esigenze nutrizionali specifiche delle specie di Legionella.

Il carbone attivo decompone il perossido di idrogeno, un prodotto metabolico tossico, e può anche catturare la CO₂ e modificare la tensione superficiale. L'aggiunta del tampone aiuta a mantenere il pH adatto alla crescita ottimale. La selettività aumenta con l'aggiunta di vancomicina e polimixina B, che inibiscono i batteri Gram-positivi, e di cicloesimide o natamicina, agenti antifungini che inibiscono la crescita dei lieviti.

Tecnica

Fare riferimento alle norme ISO 11731 e 11731-2 o ad altre procedure normalizzate per ottenere colonie isolate dai prelievi e dai campioni. Lasciare riposare le piastre inoculate finché l'inoculo non è stato assorbito. Capovolgere le piastre e incubare a 36 ± 1 °C fino a 5-10 giorni. Per mantenere umida l'atmosfera dell'incubatore, mettere una vaschetta d'acqua sul fondo dell'incubatore. Rabboccare la vaschetta con acqua fresca (se necessario) ogni volta che si esaminano le piastre. L'incubazione in atmosfera d'aria con il 2,5 % (frazione di volume) di CO₂ può favorire la crescita di alcune Legionella, ma non è essenziale.

Esaminare le piastre con un microscopio per piastre almeno tre volte, a intervalli da 2 a 4 giorni, durante il periodo di incubazione di 10 giorni, perché Legionella cresce lentamente e può essere mascherata dalla crescita di altri microrganismi. Registrare il numero di ciascun tipo di colonia presente.

Le colonie di Legionella sono spesso di colore bianco-grigio-blu-porpora, ma possono essere marroni, rosa, verde lime o rosso intenso. Sono lisce, con bordi regolari, e hanno un caratteristico aspetto a vetro smerigliato. Alla luce ultravioletta le colonie di diverse specie hanno un'autofluorescenza bianca brillante, altre sono rosse e L. pneumophila appare verde opaco, spesso con sfumature gialle. Tutte le colonie presuntive vanno confermate con metodi colturali, biochimici, sierologici o genetici.

Nota: se il terreno si usa con il metodo della membrana filtrante, il colore e la crescita delle colonie possono essere alterati. È consigliabile che il tecnico esegua una validazione della membrana filtrante usata.

LC-985 (20 piastre da 90 mm) e LC-4730 (piastre per filtrazione su membrana)

La formulazione attuale di questo terreno è conforme alla norma ISO 11731:2017, ma BCYE Agar si basa su una modifica di un terreno descritto in precedenza.

LC-985: la selettività aumenta con l'aggiunta di vancomicina o cefazolina sodica, che agiscono contro i batteri Gram-positivi, di polimixina B, che inibisce i batteri Gram-negativi, di anisomicina, che ha un ampio spettro di attività, e di cicloesimide o natamicina, che come agenti antifungini inibiscono la crescita dei lieviti.

LC-4730: la selettività aumenta con l'aggiunta di vancomicina, che agisce contro i batteri Gram-positivi, di polimixina B, che inibisce i batteri Gram-negativi, e di cicloesimide, che come agente antifungino inibisce la crescita dei lieviti.

Fare riferimento alla norma ISO 11731:2017 o ad altre procedure normalizzate per ottenere colonie isolate dai prelievi e dai campioni. Lasciare riposare le piastre inoculate finché l'inoculo non è stato assorbito. Capovolgere le piastre e incubare a 36 ± 2 °C fino a 2, 3, 5-10 giorni. Per mantenere umida l'atmosfera dell'incubatore, mettere una vaschetta d'acqua sul fondo dell'incubatore. Rabboccare la vaschetta con acqua fresca (se necessario) ogni volta che si esaminano le piastre. L'incubazione in atmosfera d'aria con il 2,5 % (frazione di volume) di CO₂ può favorire la crescita di alcune Legionella, ma non è essenziale.

Esaminare le piastre con un microscopio per piastre almeno tre volte, a intervalli di 2, 3 e fino a 5 giorni, durante il periodo di incubazione di 10 giorni, perché Legionella cresce lentamente e può essere mascherata dalla crescita di altri microrganismi. Registrare il numero di ciascun tipo di colonia presente.

LC-985 (20 piastre da 90 mm) e LC-4730 (piastre per filtrazione su membrana)

Controllo fisico-chimico

Controllo microbiologico

Semina a spirale / metodi MF: intervallo pratico 100 ± 20 UFC, minimo 50 UFC (produttività) / 10⁴-10⁶ UFC (selettività).

Controllo microbiologico secondo ISO 11133:2014/Amd 1:2018.

Metodologia analitica secondo ISO 11133:2014/Amd 1:2018; A2:2020.

Aerobiosi. Incubazione a 36 ± 2 °C. Lettura a 2-5 giorni per L. pneumophila, a 5-10 giorni per L. anisa e a 3 giorni per la selettività.

Il terreno di riferimento è GVPC convalidato.

LC-4730, piastre per filtrazione su membrana: controllo microbiologico

Filtrazione su membrana / intervallo pratico 100 ± 20 UFC, minimo 50 UFC (produttività) / 10⁴-10⁶ UFC (selettività) / ≥ 10³ UFC (specificità).

Controllo microbiologico secondo ISO 11133:2014/Amd 1:2018.

Metodologia analitica secondo ISO 11133:2014/Amd 1:2018; A2:2020.

Aerobiosi. Incubazione a 36 ± 2 °C. Lettura a 2-5 giorni per L. pneumophila, a 5-10 giorni per L. anisa e a 3 giorni per la selettività.

Controllo di sterilità

Incubazione 48 h a 30-35 °C e 48 h a 20-25 °C: NESSUNA CRESCITA.

Controllo a 7 giorni dopo l'incubazione nelle stesse condizioni.

• ATLAS, R.M. & L.C. PARKS (1993) Handbook of Microbiological Media. CRC Press. Boca Raton. Fla. USA.
• CLESCERI, L.S., A.E. GREENBERG & A.D. EATON (1998) Standard methods for the examination of water and wastewater. 9-106. 20th edition. APHA-AWWA-WEF. Washington DC, USA.
• EDELSTEIN, P.H. (1981) Improved semiselective medium for the isolation of Legionella pneumoniae from contaminated clinical and environmental specimens. J. Clin. Microbiol. 14(3):298.
• FEELEY, J.C., R.J. GIBSON, G.W. GORMAN, N.C. LANGFORD, J.K. RASHEED, C.D. MACKEL & W.B. BAINE (1979) Charcoal-Yeast Extract Agar: Primary isolation medium for Legionella pneumophila. J. Clin. Microbiol. 10(4) 437.
• ISO 11731 Standard (2017) Water Quality - Enumeration of Legionella.
• ISO 11133:2014/Amd 1:2018. Microbiology of food, animal feed and water. Preparation, production, storage and performance testing of culture media.
• MacFADDIN, J.F. (1985) Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical Bacteria.
• PASCULLE, A.W., J.C. FEELEY, R.J. GIBSON, L.G. CORDES, R.L. MYEROWITZ, C.M. PATTON, G.W. GORMAN, C.L. CARMACK, J.W. EZZELL & J.N. DOWLING (1980) Pittsburgh pneumonia agent: Direct isolation from human lung tissue. J. Infect. Dis., 141:727.
• UNE-EN ISO 11133 (2014). Microbiología de los alimentos para consumo humano, alimentación animal y agua - Preparación, producción, conservación y ensayos de rendimiento de los medios de cultivo.
• WARD, K.W. (1995) Processing and interpretation of specimens for Legionella spp. In "Clinical Microbiology Procedures Handbook" Chap. 12.1 edited by H.D. Isenberg. ASM Press. Washington DC, USA.